实验田相应浓度下土壤理化性质对Bt Cry1Ab杀虫蛋白吸附的影响(1)

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摘 要：本文研究了Bt Cry1Ab杀虫蛋白在钠质蒙脱石 （M-Na） 和土壤粘土上的吸附。研究目的不在于找到种植Bt玉米（MON810）实验田土壤对Bt蛋白的吸附能力，而是总结试验田典型浓度下的Cry1Ab抗虫蛋白的吸附规律。动力学试验表明，抗虫蛋白在M-Na表面吸附迅速（<60分钟）。在蒙脱石的浓度变化和保持抗虫蛋白的加入量不变（20和45 ng ml-1）的条件下，随着蒙脱石浓度的增加，每单位重量的蒙脱石对Cry1Ab蛋白的吸附量减小。Cry1Ab蛋白在蒙脱石上的吸附量随着悬浮液pH值的升高而减少。所有的吸附等温线都可由有含参数K的线性回归线来描述，直线的斜率为分配系数。尽管它们的矿物成分几乎相同，不同的土壤粘粒表现出不同的K值。K值的不同与土壤粘土组分的物理和化学性质有关，例如有机碳含量，比表面，粘土表面的电动电荷以及外部表面电荷密度。土壤有机质含量和土壤表面电荷量的增加会引起分配系数K值的减小，而土壤粘土组分的外表面积的增加会导致K值的增大。

在原文来源：S Pagal-Wiedar et al., Effects of physical and chemical properties of soils on adsorption of the insecticidal protein （Cry1Ab） from Bacillus thuringiensis at Cry1Ab protein concentrations relevant for experimental field sites. Soil Biology and Biochemistry 39. 2007: 3034–3042.

吸附在土壤粘粒上Cry1Ab蛋白质中不到10%的为可逆吸附，能够被解吸，蒸馏水的解吸率比CaCl2（2.25mmol）和溶解性有机碳（50 mg Cl-1）溶液高。
关键词：Cry1Ab杀虫蛋白；苏云金芽孢杆菌；Na-蒙脱石；土壤粘粒；吸附；解吸；有机碳；比表面；表面电荷；表面电荷密度。
1 引言
最近几年转基因植物（GMP）的种植区域明显增加，例如，在2005年，全球的GMP种植面积从2004年的8100公顷上升为9000万公顷（James, 2005）。一种基因修饰植物如玉米能合成Bt毒蛋白，该蛋白能直接抵御欧洲玉米螟幼虫的危害，从而使这些植物（这里我们称之为转Bt植物）免受害虫的干扰。
Bt基因植物所合成的杀虫蛋白通过不同的途径进入土壤，例如，在生长期内通过根系分泌物进入土壤（Saxena et al., 1999; Saxena and Stotzky, 2000），转基因植物收货后残余的生物量被纳入土壤（Tapp and Stotzky, 1998; Stotzky, 2000），还有一些通过花粉进入土壤（Losey et al.,1999）。在大田条件下，土壤中最高含量的Bt内毒素存在于活的根片段中。其次含量较高的是在分解的前茬玉米残体中检测到的（Hopkins and Gregorich, 2003）。抗虫蛋白在根际土中的含量比在转基因玉米（MON810）的田间土体土块中的含量要高（Baumgarte and Tebbe, 2005）。由于Bt毒素与土壤成分的相互作用，导致苏云金芽孢杆菌所产生的部分杀虫蛋白能够抵抗微生物降解而残留于土壤中（e.g., Koskella and Stotzky, 1997; Saxena and Stotzky, 2000; Stotzky, 2000, 2004），被土壤成分所约束的该毒素生物利用度降低，并且不易退化。因此，这种毒素可在土壤环境中积累（Crecchio and Stotzky, 1998, 2001; Tapp and Stotzky, 1998; Vettori et al.,2003; Muchaonyerwa et al., 2004）。此外，当与土壤粒子结合后，这种转Bt毒素的杀虫活性会保留，有时甚至会增强（Tapp and Stotzky, 1995; Crecchio and Stotzky, 1998; Zhou et al., 2005）。然而，Bt毒素在土壤中的持久性，以及他们的微生物降解是土壤类型，环境条件，蛋白质来源（植物的产生或纯毒素）和特定杀虫蛋白的研究多种因素共同作用的结果（Clark et al., 2005）。
几项研究已经调查了转Bt毒素在土壤中的行为，以及土壤颗粒对Bt毒素的吸附（e.g., Stotzky, 2004）。由于其大的比表面积和高阳离子交换量，粘土矿物质和腐植物质是土壤中最重要的吸附物质（Sposito, 1984; Stotzky, 1986）。因此，粘粒对Bt毒素的吸附量大于沙粒和原土（Muchaonyerwa et al., 2006）。Bt毒素在蒙脱石（M）上的吸附量比在高岭石（K）上的大（Venkateswerlu and Stotzky, 1992; Tapp et al., 1994; Lee et al., 2003）。最大吸附发生在30分钟内，更长时间的接触并没有引起转Bt毒素吸附量的增加（Crecchio and Stotzky, 2001; Venkateswerlu and Stotzky, 1992; Lee et al., 2003; Zhou et al., 2005）。转Bt毒素在沙质壤土的最大吸附需要3小时而在粘壤土中的最大吸附需要4小时（Sundaram, 1996）。Btk杀虫蛋白迅速强烈的在M-腐殖酸-Al-羟基聚合物上吸附（Crecchio and Stotzky, 2001）。腐殖酸对Bt毒素的结合和吸附作用随着腐殖酸增加而增大（Crecchio and Stotzky, 1998）。此外，Bt蛋白在粘土矿物上的吸附量在7-50℃时不受温度的影响（Venkateswerlu and Stotzky, 1992; Zhou et al., 2005）；它在pH值接近蛋白质的等电点（IEP）时最高（Venkateswerlu and Stotzky, 1992; Crecchio and Stotzky, 2001）；不到10％的被吸附Bt毒素可能解吸（Chevallier et al., 2003; Lee et al., 2003）；而且用双蒸水或NaCl淋洗毒素－有机矿物复合物基本上不能解吸蛋白（Crecchio and Stotzky, 2001）。Stotzky总结了Bt毒素和土壤颗粒的相互作用及其对Bt毒素存留和杀虫活性的影响（2004）。
为了更深入的了解土壤理化性质在Cry1Ab蛋白吸附中的作用，吸附实验用种植Bt玉米MON810实验田中土壤的粘粒来进行。吸附实验中使用的Cry1Ab蛋白浓度就是由Baumgarte和Tebbe（2005），Nguyen和Jehle（2007）在该实验田里测得。
我们分析了粘粒样本的理化性质，如pH值，有机碳含量，和矿物成分等。由于粘粒大小（Li et al., 1991）的原因，Bt毒素无法插入处于初级层和扩展层硅酸盐夹层之间的空间（Tapp et al., 1994），故吸附仅仅发生在粘粒的外表面。因此，也分析了粘粒的电动电荷和比表面。这些物理化学性质与Cry1Ab蛋白的吸附有关。
我们对Cry1Ab蛋白在Na-蒙脱石（M-Na）的平衡吸附时间进行固定，M-Na的浓度和pH值是不同的。Cry1Ab蛋白在M-Na上的吸附用数学方法描述。通过向实验中获得的蛋白－粘土复合物添加溶液解吸被吸附的Cry1Ab蛋白，该溶液为模拟土壤溶液含有CaCl2 （2.25 mmol）和溶解性有机碳（50 mg C L-1）。
2 材料与方法
2.1 Cry1Ab蛋白
具有胰岛素活性的纯Cry1Ab蛋白由基因工程菌Escherichia coli（Nguyen et al., 2004）制得，Johannes Jehle （SLVA, Neustadt a.d weinstr., Germany） 提供。蛋白质的分子量为66.7 kDa，由594个氨基酸残基组成。
2.2钠蒙脱石粘土组分
沉积的M -Na（<2μm）是从德国的Erbsloh & Co, Geisenheim购买的。
土壤样品采自德国的哈勒（土壤A）和波恩（土壤B和C）附近的地区。
土壤A：淋溶黑土，母质为冰川漂泥灰岩上的沙质黄土。
土壤B：滞水淋溶土，母质为黄土。
土壤C：滞水雏形土，母质为泥流碎屑。
试验所用土壤是从种植转Bt基因玉米（MON810）三年的大田采集来的。土壤样品取自表土（土壤A：5-10厘米;土壤B和C：0-30厘米）和底土（土壤A：40-45厘米;土壤B和C：40-60厘米）。风混匀风干土样，磨细过2 mm筛。不同土壤的粘土组分进行分离沉淀：取50克的风干样品（< 2 mm）于5L未加入任何化学分散剂的蒸馏水中轻轻搅拌溶解。根计算时根据斯托克斯法，表明上方的水仅包含不到2 μm的粘粒。重复以上操作直到所得的粘土颗粒不再增加。为了进行X -射线衍射（XRD）分析，粘粒用MgCl2（1 mol L-1）洗涤3次进行Mg2+ 饱和，再用蒸馏水清洗直到上清液是无氯离子，测定电导率，并冷冻干燥，储存在聚乙烯管备用。
2.3 表征土壤粘土组分
用0．0lmol／L氯化钙溶液浸提土壤，水土比为2.5：1通过测定电势来测定土壤的pH。
土壤有机碳含量通过测定样品在氧气中干烧所产生的二氧化碳的含量来测定。
XRD分析用薄定向样品的载玻片进行扫描，CuKα靶辐射（Stoe, Stadi/P），扫描步长为2，扫描角度2θ为30°（Dultz，2001）。用来进行XRD的样品先用H2O2（30 ％）氧化去除土壤有机质，这并没有改变粘土矿物的三维结构（Jasmund and Lagaly, 1993）。
关于Cry1Ab蛋白在土壤粘粒吸附的表征，粘土颗粒外表面的电动电荷由结合了自动滴定仪（Mettler Toledo DL25，Gieβen，Germany）的粒子探测器测定（PCD03，Mutek， Herrsching，Germany），该PCD03测定了粘土粒子外表面的动电电荷量。PCD03的测量原理基于流动电流检测器（SCD），由Gerdes（1966）第一次发明。表面负电荷量由有机聚合物滴定法测定（polydiallyldimethylammonium chloride，1 mmol L-1）。对带正电荷的样品，则用有机高分子阴离子，钠聚乙烯磺酸钠（1mmol L-1）测定。外表面的电荷量由所需的电解质的量来计算（Bockenhoff and Fischer, 2001）。
根据布鲁诺尔等（1938）的方法，比表面由单点吸附和在-196℃条件下用Quantasorb表面分析仪获得的解吸氮决定（Quantachrome，Odelzhausen，Germany）。吸气和脱气之前，样本需要在120℃平衡真空条件下脱气至少2小时。比表面的计算使用布鲁诺尔-埃米特-特勒（BET）方程。
2.4 吸附和解吸研究
样品制备。为了防止微生物降解Cry1Ab蛋白，吸附和解吸实验在无菌的条件下进行。粘粒悬浮液（10％）用去离子水制备，加热到100℃持续20分钟，在35℃下培育过夜。这一过程重复3次（tyndallization），并将0.5 ml等分试样的粘粒转移到含有4.5 ml营养液（Merck, Darmstadt, Germany）或梭菌媒介中（Oxoid, Wesel, Germany）。该管在30℃进行为期10天的有氧或无氧培育。厌氧培养气瓶由Anoxomats系统控制90％的N2，5％的H2，5％CO2 （Mart Microbiology, Lichtenvoorde, The Netherlands）。当没有观察到微生物生长时，粘粒悬浮液即为无菌的。x-衍射表明加热粘土并没有改变其结构。粘土悬浮液在4℃下储存在玻璃管中。
动力学研究。当Cry1Ab蛋白在溶液中的量随时间变化保持常数时，吸附就达到了平衡。动力学试验在某一Cry1Ab蛋白浓度下进行，以确定达到吸附平衡所需要的时间。将100 µl无菌溶液的M-Na（10mg）和Cry1Ab蛋白溶液（40 ng ml-1）混合，用去离子水定容到1 ml。混合物置于横向振动筛（100 rev min-1）在20±2℃振荡10，20，30和60min。在每一个时间间隔，混合物在22 640 g离心5 min（Universal 30F, Hettich, Tuttlingen, Germany）。测定Cry1Ab蛋白在开始和平衡上清液中的浓度用Agdia 的商业酶联免疫吸附试验（ELISA）（Elkhart, IN, USA）测定。Cry1Ab蛋白吸附和解吸的量通过在开始及平衡时蛋白质浓度的改变来计算。在反应管壁上没有Cry1Ab蛋白的吸附，且只含Cry1Ab蛋白溶液的对照管没有粘粒悬浮物。
粘土浓度对吸附的影响：通过将不育粘土的浓度从2.5到50mg ml-1进行变化的方法来研究Cry1Ab蛋白吸附依赖于悬浮的M -钠（pH值7.1）的浓度。将Cry1Ab蛋白溶液（20或45ng ml-1）与不同浓度的M -钠悬着液混合，用去离子水定容至1毫升。温度为20±2℃情况下，该悬液在水平摇床（100 rev min-1）震荡30分钟后离心。处理后的悬液中抗虫蛋白浓度按照上文中所说方法进行测定。
pH对抗虫蛋白吸附的影响：分别使用分析纯盐酸（0.1 M）或氢氧化钠（0.1 M）调整M-Na （pH 7.1）无菌悬着液和抗虫蛋白液的pH值在6至8.7范围内。该范围内的pH值对应于各地试验田的。在将M –Na悬浮液与Cry1Ab蛋白液混合后，悬浮液置于横向振动筛中（100 rev min-1）在20±2℃振荡30min，粘土－蛋白悬浮液pH在离心之前测定。测定Cry1Ab蛋白溶液的浓度。
吸附等温线研究。要获得吸附等温线，每100µl的粘粒悬浮液加入10 mg的土壤粘土或M -Na（pH 7.1），然后与浓度范围从0到80 ng ml-1 Cry1Ab蛋白溶液混合。pH没有调整到固定值是为了测量Cry1Ab在所用试验田pH下的吸附。（pH值见表1）。加入去离子水，定容到1ml，悬浮液置于横向振动筛中（100 rev min-1）在20±2℃振荡30min，离心，测定Cry1Ab蛋白溶液的浓度。
解吸研究：解吸实验由450µl的去离子水，CaCl2（2.25mmol）和溶解土壤有机质（50mg Cl-1）重新分散吸附后Cry1Ab蛋白的颗粒完成。悬浮液在横向振动筛中（100 rev min-1）于20±2℃振荡30min后达到平衡，离心，测定悬液中Cry1Ab蛋白的含量。
表1 土壤粘粒的物理和化学性质

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