肠道菌群的功能与检测技术探究

全惠珍,普法栏目剧落花无声,刘邦论得天下之道阅读答案

　　Abstract：A large number of microorganisms are found in the gastrointestinal tract of animals, after a long period of evolution and selection, they form a dynamic microbial system. The interaction between intestinal flora and organism is very important for animals themselves. In recent years, it has become a hot topic. The function of intestinal flora is mainly reflected in biological barrier, nutrition and immunity. The detection method of intestinal flora is the important and difficult problem in the study of intestinal flora. The main techniques are isolation culture, mass-spectrometric technique and metagenomic sequencing technique. According to lots of references, the paper summarizes the current study results and research techniques for intestinal flora function.

　　Keyword：intestinal flora; flora function; detection technique; isolation culture; mass-spectrometric technique; metagenomic sequencing technique;

　　动物肠道内存在着大量的微生物, 这些微生物在经过长期的进化与选择之后逐渐形成了一个动态的微生物系统。文章从肠道菌群的生物屏障作用、营养作用、免疫作用等方面介绍了肠道菌群功能, 总结了目前研究中常用的肠道菌群检测技术———分离培养、质谱技术、宏基因组测序等, 并对几种检测技术进行对比和分析, 对未来可能的研究发展方向进行预测。

　　1、肠道菌群介绍

　　肠道菌群, 即肠道内的正常微生物。人体的肠道菌群是一个由近1 014个微生物复合生态系统组成的复杂生态系统[1]。科学家对肠道微生物的研究可以追溯到1886年, 当时已经有人发现了大肠杆菌并指出其对消化的作用。后来又有学者提出了“梅氏假说”, 即酸奶中所富含的乳酸菌可以对肠道菌群产生作用, 减少腐败菌在肠道中的生长。之后关于肠道菌群与机体关系的相关探索逐步加深, 科学家们逐渐发现肠道菌群对于宿主的重大影响, 并称其为“被忽略的人体器官”。

　　动物肠道内存在着30属500多种细菌, 主要为厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌, 数量最多的为类杆菌、优 (真) 杆菌、消化球菌及双歧杆菌等专性厌氧菌, 占99%以上, 其中仅类杆菌及双歧杆菌就占细菌总数的90%以上。其余还有数量较少的大肠杆菌、肠球菌、乳杆菌及韦荣小球菌, 数量最少的葡萄球菌、魏氏梭菌、变形杆菌等。

　　已有相关研究证实, 肠道菌群既有“共性”, 也有“个性”[2], 这主要体现在不同宿主体内的微生物菌群组成情况上。不同个体相比, 肠道菌群的主要组成类群非常相近, 并都可分为拟杆菌型、普氏菌型及瘤胃球菌型, 但微生物菌群的相对含量和菌株种类在不同个体间的差异却十分显着, 其影响因素主要为生存环境[3]、年龄[4]、生理状况[5-6]等, 除此之外饮食也是造成以上区别的一个重要原因, 并且相对容易改变和控制。在各种因素影响着肠道菌群组成结构的同时, 肠道菌群也在对宿主的各个方面产生不同程度的作用与影响。目前, 肠道菌群已经成为科学家们研究的重点与热点问题, 并且已经有许多相关研究取得了进展。

　　2、肠道菌群的功能

　　2.1、生物屏障作用

　　肠道菌群的生物屏障作用即指颉颃外来致病菌的作用。早在1887年就已经有科学家观察到微生物之间具有颉颃作用, 并利用这种颉颃作用成功预防和治疗了家兔的炭疽病。1973年有人提出肠道菌群的减少可导致仔鸡容易被致病性沙门氏杆菌感染。随着科学家对肠道菌群的深入研究, 证实了肠道菌群具有保护机体、抵御外来致病菌的作用。

　　肠道菌群的这种功能又被人为地划分成生物屏障和化学屏障。生物屏障即指肠道正常菌群定殖于肠道中, 以此对外来致病菌的定殖占位造成影响, 使其无法在宿主体内定居生长和繁殖。而化学屏障是指肠道菌群代谢产物 (如乙酸、过氧化氢、细菌素等) 对外来致病菌能够产生致命作用或者可以减少其在肠道内的定殖。

　　2.2、营养作用

　　肠道菌群的营养作用体现在多个方面。首先, 其可消耗致病菌生长所需要的各种营养物质, 从而抑制外来致病菌的生长繁殖, 并利用宿主体内不存在的酶弥补宿主在消化酶上的缺陷[7]。这种行为加强了宿主机体对外来致病菌的抵御作用, 并使得宿主对于各种营养物质的吸收利用能力更强。其次, 肠道的正常微生物 (如双歧杆菌、乳酸杆菌等) 能合成多种人体生长发育所必需的维生素, 如B族维生素 (维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12) 、维生素K、烟酸、泛酸等, 还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸, 如天冬门氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸等, 并参与糖类和蛋白质的代谢, 同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收, 这些营养物质对于宿主的机体来说是必需的, 它们的缺乏会导致机体功能失常。细菌还可以通过氧化、还原、水解等反应使氨基酸脱氨产生氨、二氧化碳, 以及乙酸、丙酸、丁酸、丙酮酸、琥珀酸等有机酸。

　　2.3、免疫作用

　　肠道是动物与外界环境接触最多的器官之一, 也是机体最大的免疫器官。肠黏膜中分布着超过全身半数的淋巴组织。肠道中定殖了大量的微生物。肠黏膜屏障包括机械屏障、免疫屏障与生物屏障。肠道正常菌群对肠黏膜免疫屏障功能的调控扮演着双重角色。一方面, 肠道菌群作为抗原对肠黏膜存在潜在的危害;另一方面, 肠内寄生菌可为肠黏膜细胞提供某些营养成分, 维持肠道菌群平衡, 激活肠道免疫系统[8]。

　　除此之外, 动物肠道菌群作为抗原物质还能促进宿主的免疫器官发育, 增加T、B淋巴细胞的数量, 产生非特异性免疫作用;通过对宿主免疫系统的持续刺激, 使其产生免疫反应来增加机体的免疫能力[9]。例如双歧杆菌, 它是动物肠道内数量最多的有益菌, 含有肠道寄生菌共同抗原, 可以影响黏膜免疫的主要效用因子分泌性球蛋白, 在对机体的特异性与非特异性免疫上影响巨大[10]。

　　已经有相关研究证明减少接触微生物的机会, 会导致慢性炎性疾病的增多, 并指出这可能是导致机体免疫调节缺陷的一个重要原因。菌群失调时, 会导致机体的免疫紊乱和屏障功能减弱, 这也是证明肠道菌群与机体免疫之间关系紧密的一个方面[11]。

　　在实践和生产中, 肠道菌群已经有和疫苗混合使用来提高抗体水平和作为具有免疫活性的佐剂的应用。如在新城疫疫苗接种前后给鸡喂食益生素, 可以提高鸡血清中抗新城疫病毒血凝抑制抗体的含量并延长抗体的高峰期。光合细菌与H52混合使用, 可以提高鸡体内的γ-球蛋白和鸡传染性支气管炎病毒抗体水平。有关研究指出双歧杆菌具有免疫佐剂活性。目前, 乳酸杆菌、链球菌、双歧杆菌、芽孢杆菌已经被制成活菌制剂, 已有多种制剂被广泛应用于微生物饲料添加剂和治疗剂中, 用来防治动物肠道疾病。

　　2.4、其他作用

　　肠道菌群对机体除了具有屏障作用、营养作用和免疫作用之外, 还能对机体的造血功能产生直接或者间接的影响。有学者使小鼠肠道微生物消失导致其骨髓和外周血中粒细胞生成减少, 从而证明了这一观点。肠道正常菌群可以产生超氧化物歧化酶, 使宿主体内的自由基歧化反应加速, 有一定的抗衰老作用。肠道菌群还能产生多种酶, 对肿瘤的产生有抑制作用[12]。肠道菌群对情绪也有影响, 还可通过肠-脑轴影响宿主的行为[13]。

　　3、肠道菌群检测技术

　　3.1、分离培养

　　分离培养是最早在试验中使用的一种方法, 目前已经相对比较成熟, 应用于许多研究领域。该方法主要是利用选择性培养基把各种细菌分离开, 并根据染色、生化反应、血清学试验等方法对分离出的细菌进行鉴别, 这种方法还可以用来测定活菌的数量。例如, 徐凤等[14]对2月龄断奶羔羊、8月龄和2岁山羊瘤胃和回肠刮取物中的乳酸菌进行分离鉴定;白娜[15]利用纯培养技术与16S r DNA技术结合对采集自内蒙古锡林郭勒牧区的36份健康家畜粪便样品中的微生物进行了分离鉴定;聂远洋等[16]利用不同培养基研究了不同年龄麦洼牦牛肠道菌群与其群落结构的变化。这种利用不同培养基分离培养细菌的方法虽然已经比较成熟, 能显示出不同细菌对宿主肠道系统中各种营养物质的利用情况, 但也有一定的缺点, 如该方法不仅耗时长而且进行研究的微生物种类具有很大的局限性, 自然界中有90%~99%的微生物无法通过分离培养的方法进行分析, 显然可分析的这一小部分微生物对研究肠道菌群这个整体和肠道微生物系统与宿主的关系来说是远远不够的。

　　3.2、质谱技术

　　质谱技术是利用肠道菌群中不同菌种的组成蛋白种类不同这一特性来对蛋白质的种类进行鉴定, 从而得出其组成细菌的功能和特性的。基质辅助激光解析电离时间飞行质谱 (MALDI-TOF) 的出现, 成为从蛋白质水平对肠道菌群进行研究的有效工具。质谱技术的原理是利用激光辐射微生物样品与等量基质溶液挥发后形成的晶体, 基质吸收能量解析而样品分子电离, 对形成的离子峰与离子质荷比的指纹图谱进行分析比较, 然后再进行比对区分出肠道菌群的种类。该方法在研究不同肠道菌群的种类时快速而准确, 可以区分不同菌群与不同状态下的蛋白质图谱。但这种方法对样品的采集和处理要求较高, 且质谱技术的分析方法目前并不成熟, 还需进一步优化。

　　3.3、宏基因组测序

　　1998年宏基因组的概念被提出, 当时人们对它的定义是环境中所有微生物的遗传信息, 目前主要是指环境中细菌和真菌基因组的和[17]。宏基因组测序技术又分为16S r DNA技术和全基因组测序技术。

　　16S r DNA技术是目前肠道菌群系统分类研究中最常用的一种方法, 相较于5S和23S r DNA, 16S r DNA大小适中, 既容易获取又能明显比较出不同菌群的区别。16S r DNA技术的原理是通过直接获取肠道菌群的DNA信息, 与基因库中的数据进行比较, 经过分析后可以对其进行分类。目前所有已知细菌的16S r DNA碱基序列都已经可以在基因库中找到, 这也为16S r DNA测定法在试验研究中的广泛应用奠定了基础。王纯等[18]用该方法对草鱼与团头鲂的肠道菌群结构进行了比较分析, 提出了草鱼和团头鲂消化道内微生物群落营养物质的代谢方式类似的观点。这种技术解决了传统的微生物鉴定方法难以鉴定众多的生长习性复杂的微生物的问题, 目前已经在许多研究中被使用。但是16S r DNA技术的费用较高、耗时长且不能进行定量分析, 而且该技术依赖于PCR技术, 在PCR中存在的样品容易污染的问题也会影响16S r DNA的分析结果, 所以仍需对肠道菌群丰度和数量准确变化的测定方法进行优化。

　　全基因组测序即对样品核酸进行提取, 测定其序列并对结果进行分析。测定过程中省略了扩增程序, 直接获取核酸信息, 与数据库中的信息进行比对, 经过分析后得出致病菌的种类, 用于检测样品中毒性菌株的耐药性, 进行相关毒理学研究。高菽蔓等[19]利用全基因组测序研究了犬副流感病毒CC-14株全基因组序列特征。这种方法解决了传统研究方法需要菌群分离的过程, 更快速、便捷, 也解决了有些菌种难以用传统方法培养的问题。与16S r DNA技术相比不需要进行PCR扩增, 避免了扩增过程中样品被污染的可能, 结果更准确可靠。目前, 这种方法被广泛应用于肠道菌群和环境菌群的研究之中, 对于菌群的毒力作用与生活史的研究具有重要意义。

　　3.4、其他技术

　　分子标记法的灵敏性和特异性较高, 常见的具体方法有荧光原位杂交技术、基因芯片技术等。荧光原位杂交技术可以研究肠道细菌和其余组织之间的关系, 并且可以保持肠道菌群与肠道组织的原本情况。基因芯片技术即DNA微阵列, 具有在处理多个基因时高效快速的特点。

　　DNA指纹图谱分析法依赖于分析对象的分子大小与核酸序列的不同, 其中的变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 技术目前已经可以分辨出只有一个碱基差异的基因序列, 弥补了传统研究方法精度不高的缺点, 被广泛应用于微生物多样性和种群差异的研究中。

　　这些对肠道菌群的研究方法在使用时并不是唯一的, 在实际的研究中, 有时可能会两种甚至多种方法并用进行鉴定研究。

　　4、小结

　　人们已经意识到了肠道微生物对于宿主机体的重要性, 不论是肠道菌群带给机体抵御外来致病因素的屏障作用, 对于机体的营养作用、免疫作用, 还是其他作用, 对于宿主来说都是不能忽视的。失去了肠道正常菌群的作用, 机体会受到严重的损伤与一些功能的丧失。现在已经有许多的科学家投入到了肠道菌群的研究中, 为揭示肠道菌群与宿主之间的关系和影响作出了巨大的贡献。但是这些研究成果对于肠道菌群与机体相互作用的整体来说仍然只是其中的一小部分, 仍然还有许多的内容等待学者们去研究。例如, 肠道菌群对宿主机体作用的机制目前尚未完全研究清楚, 肠道菌群是如何对宿主的健康甚至情绪产生影响的也尚无定论。

　　相较于传统的肠道菌群研究方法, 目前的技术手段已经取得了非常大的进步。但是这些技术仍然存在缺陷, 对于研究肠道菌群来说仍显不足, 还需进一步优化, 如对于样品的处理方式应有所突破, 对于肠道菌群的信息处理仍需优化。在未来, 期待有更简便快捷的方法出现, 并结合目前已有的研究方法, 按照需求进行选取以更有效地达到试验目的, 而借助生物大数据的方法可能会是未来研究的发展方向。

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