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摘要：银耳是我国珍贵的食用菌, 具有很大的营养作用和药用功效, 市场前景广阔。该研究初次系统地概述了银耳在分子生物学方面的研究进展, 着重阐述了银耳的生物学分类, 基因克隆、遗传转化、分子标记、基因组学等方面在银耳研究中的应用与发展, 以期为进一步开展银耳的分子生物学研究提供参考依据。
关键词：银耳; 分子生物学; 食用菌;
银耳 (Tremella fuciformis) , 又名白木耳、雪耳, 食、药两用, 其营养价值和药用功效极高, 是非常珍贵的食用真菌, 有“菌中之冠”的美称。我国银耳的研究与栽培在全世界处于领先地位, 以四川通江和福建古田等地区为银耳的道地产区, 分别以段木 (青杠木) 栽培和代料 (瓶栽、袋栽) 栽培为代表;通江段木银耳的产量和质量居全国首位, 全国90%的银耳为古田代料银耳[1]。对银耳的研究主要集中在生物学特性、生产栽培、病虫害防治、加工技术、分离纯化、药用功能、经济价值、遗传育种等方面[2-4]。基于核酸的银耳分子生物学研究始于20世纪80年代初[5], 至今仍是研究的热点和前沿。该研究首次对基于核酸的银耳研究结果及现状进行了比较全面的综述, 以期为银耳的分子生物学研究提供参考依据。
1 生物学分类
传统的真菌分类依据是孢子的类型和有性态的有无, 银耳隶属于真菌门 (Eumycota) 、担子菌纲 (Baisidomycetes) 、银耳目 (Tremellales) 、银耳科 (Termellaceae) 、银耳属 (Tremella) [2]。从系统学来看, 根据形态特征对真菌分类存在诸多诟病和问题, 不能充分反映物种的进化关系;从应用和方法学来说, 真菌的形态结构也复杂多变, 获得有性或无性器官所需时间较长[6]。传统的真菌命名方法导致真菌命名复杂化, 给相关研究带来诸多不便。随着以核酸 (DNA、RNA) 序列分析为主的分子系统学的广泛应用, “一种真菌一个名称”新规则为广大学者所接纳[7]。ANA等[8]依据核糖体的3个标记分子 (nSSU、5.8S、nLSU) 的rDNA序列构建了银耳纲 (Tremellomycetes) 的分子系统发育关系。LIU等[9]通过比较分析ITS (5.8S) 、D1D2、SSU、RPB1、RPB2、TEF1、CYTB的核酸序列, 结合形态与生理特征, 构建了含银耳目 (Tremellales) 等4个目的世系分类。银耳在生物学分类中的最新研究结果为:真菌界 (Fungi) , 担子菌门 (Basidiomycota) , 伞形亚门 (Agaricomycotina) , 银耳纲 (Tremellomycetes) , 银耳目 (Tremellales) , 银耳科 (Tremellaceae) , 银耳属 (Tremella) [8-9]。
2 核酸提取
高质量的核酸是进行后续分子试验 (PCR、遗传转化、基因克隆等) 的前提和保证。刘娟等[10]采用CTAB法等5种方法分别提取银耳芽孢基因组DNA, 通过评估DNA的得率、纯度, RAPD扩增和酶切效果, 确定CTAB法是这5种提取方法中最适合银耳芽孢基因组DNA提取的方法。银耳芽孢是核酸提取的主要材料, 少有菌丝体和子实体提取报道。王凡华等[11]用改良法的质量分数5%CTAB法提取银耳干品的DNA, 获得了较高质量的DNA, 适于RAPD扩增反应;此法提取的DNA也适于分子标记和转基因成分检测。HUNG等[12]以银耳子实体为材料, 商品化的植物RNeasy试剂盒提取出银耳的总RNA, RT-PCR获得了cDNA, 通过RACE-PCR获得了编码银耳免疫调节蛋白 (TFP) 基因的全序列。总的来讲, CTAB法提取的核酸质量较好, 得率高, 而商业化的试剂盒提取的核酸质量好, 但得率相对较低。
3 基因克隆
在食用菌中, 大量的香菇和双孢蘑菇的基因被克隆, 银耳的基因克隆也取得了一定的进展。α-微管蛋白是微管的重要组成蛋白, α-微管蛋白基因在真核生物中具有高度的序列保守性, 作为管家基因之一, 常用作内参照基因在荧光定量PCR、抑制差减杂交、基因芯片和Northern blot等分子生物学试验中使用。董吉元等[13]分别用RACE和SEFA-PCR方法克隆了银耳α-微管蛋白基因的cDNA和DNA全长序列, 其cDNA全长1 347bp, DNA全长1 962bp, 含9个内含子, 编码448个氨基酸;氨基酸序列中存在保守的GTP结合区域GGGTGSG, 编码的蛋白质属于Tubulin_Fts Z超家族中的α-微管蛋白亚家族, 银耳α-微管蛋白基因的cDNA序列与新型隐球酵母的相似性为80%, 系统发育树显示银耳与新型隐球酵母距离最近。该研究可为鉴定银耳二型态相关的差异表达基因、银耳分子育种和系统发育研究提供参考, 也可利用银耳α-微管蛋白基因的启动子构建高效的表达载体进行银耳转化与基因功能研究。聂燕华等[14]用cDNA-AFLP技术对用纤维二糖和乙醇2种碳源诱导培养银耳芽孢的差异细胞, 克隆了14条特异性的差异表达基因片段, 有5条差异序列在纤维二糖、乙醇培养样品中各有表达, 其中2条与编码细胞色素b基因具有较高同源性的序列在纤维二糖、乙醇下均表达, 1条与磷脂酶相关蛋白基因具有较高同源性的序列只在纤维二糖碳源下表达, 2条与编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ的基因具有较高同源性的序列只在乙醇碳源下表达。SUN等[15]用RT-PCR法克隆到银耳gpd的cDNA序列, 并用tail-PCR法从银耳中分离到编码银耳gpd上游500bp启动子序列, 克隆的启动子能有效地驱动外源基因在银耳中表达。用反向长距离PCR技术克隆了3个具有活性的银耳内源gpd启动子, 分别为466、708、885bp, 酶活测定表明大片段的gpd启动子的表达活性更高, 表明大片段具有更完整的表达元件, 与已报道的其它gpd启动子差异较大[16]。用硫酸铵分级和离子交换层析分离到一种能激活原代小鼠巨噬细胞的免疫调节银耳蛋白TFP, TFP分子量为24kDa, 为不含糖残基的同型二聚体蛋白;用cDNA末端快速扩增技术克隆到TFP基因的cDNA序列, 该序列长408个核苷酸, 其中开放阅读框由336个核苷酸组成, 编码的蛋白质含112个氨基酸[12]。
4 遗传转化
4.1 限制性内切酶介导转化
谢宝贵等[17]用限制性内切酶介导将人工合成的人胰岛素基因转化银耳芽孢, 获得了10个人胰岛素基因转化子;EcoRI、BstXI、BamHI、BstEII、HindIII这5种内切酶都可介导转化获得大量转化子, 并证明了银耳没有GUS酶活性, 对卡那霉素有较强的抗性, 对潮霉素敏感。吴小平等[18]用双酶切法成功构建了含人工合成的蜜蜂抗菌肽基因的银耳表达载体, 表达载体的启动子为35S, 终止子为NOS, 报告基因为GUS。ZHU等[19]用限制性内切酶法将透明颤菌血红蛋白基因 (vhb) 转化银耳芽孢, 在CaMV 35S启动子调节下, 经Southern和Western杂交分析, 外源基因导入了银耳芽孢中。
4.2 PEG介导转化
郭丽琼等[20]首次利用香菇gpd-Le启动子和构巢曲霉gpd-An启动子分别驱动潮霉素抗性基因hph在银耳芽孢中的表达, 通过连续5代转基因芽孢继代检测证明, 25%的PEG 4000能高效介导银耳原生质体的转化, 香菇gpd-Le启动子能显着驱动外源hph基因在银耳芽孢中稳定遗传。阮玲云等[21]首次用强启动子RP27, 利用PEG介导转化法, 将pTE11-RFP转入银耳芽孢中, 验证结果表明红色荧光蛋白RFP基因成功转入到银耳芽孢中且能表达。
5 分子标记
潘丽歌等[30]用ITS序列分析了一种危害银耳栽培的病菌真菌的rDNA序列与好食脉孢霉同源性超过99%, 分子进化鉴定与形态分类结果一致, 鉴定结果该病原真菌为好食脉孢霉;且好食脉孢霉的敏感药剂主要为多菌灵可湿性粉剂、三唑酮和百菌清。张春雷等[31]用ITS对14个银耳段木栽培杂菌进行了系统发育分析, 遗传距离为0.036时, 14个菌株可以形成2个明显分枝, 分枝与地理来源之间没有明显的相关性;用ISSR分子标记分析了48个杂菌的相关性, 聚类分析表明, 在75%的相似水平时, 48个菌株可划分为5个类群, 类群的划分也与地理来源没有明显相关性;因供试菌株的ITS序列明显小于香灰菌, 利用ITS序列容易将杂菌与香灰菌分开。曲绍轩等[32]用SRAP、ISSR和RAPD分子标记鉴定了4个银耳菌株T6、T7、T8、T9, 3个标记都将4个菌株分成了3组, 结果一致。RAPD鉴定的遗传相似性为平均值81.34%, SRAP鉴定的遗传相似性为平均值68.98%, ISSR鉴定的遗传相似性为平均值为77.48%, 且3种分子标记均未能将栽培上的色泽性状区分出来。
6 遗传多样性
ITS序列分析与ISSR扩增表明, 银耳栽培杂菌之间在DNA水平上存在比较显着的遗传变异, 遗传相似性较低, 具有较丰富的遗传多样性, 且与地理来源之间无明显相关性[31]。孙淑静等[33]用4个ISSR和2个RAPD分子标记分析了福建省不同来源的14株银耳芽孢多样性, 聚类分析结果表明, 福建省栽培菌株的芽孢与野生采集分离的银耳菌株的芽孢存在一定的差异, 但栽培菌株之间没有差异, 表明其栽培菌种来源单一, 遗传背景狭窄。香灰菌是银耳菌的重要伴生菌, 一直以来关于香灰菌的分类存在较大争议, DENG等[34]用ITS序列分析和有性态的形态分析认为, 在中国野生和栽培用的香灰菌均为暗色环纹炭团菌Annulohypoxylon stygium。
7 基因组学研究
杨双熙等[35]用抑制性差减杂交技术, 以银耳芽孢和菌丝为检测对象分别构建了正向差减文库和反向差减文库, 2个文库中分别有54.24%和62.68%的基因得到功能注释, 这些基因包含信号传导、调控翻译、分子伴侣、催化、调节、结合与运输等方面;用RT-PCR技术进一步对2种型态的7个基因片段检测发现, 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶PP2A催化亚基、锌指UFMI肽酶结合域基因、MAP激酶基因、细胞壁生化合成相关蛋白基因、琥珀酰辅酶A基因、3酮酸辅酶A转移酶基因等在正、反2个文库中表达差异明显。这2个文库的构建为克隆银耳二型态相关基因和从分子水平上阐明银耳二型态的发生机理奠定了基础。黄晓星等[36]以大肠杆菌DH10B为宿主细胞, 构建了银耳菌株Tr21芽孢的cDNA文库, 通过密码子在线软件分析, 确定了18个编码银耳蛋白基因的高频密码子, 银耳密码子G+C含量为59.02%, 且密码子第三位碱基的G+C含量高达69.72%, 表明编码银耳基因的密码子偏好以G或C结尾。DENG等[37]对银耳菌株Tr26进行基因组测序, 测试结果表明, 基因组全长24.2 Mb, 预测基因为10 040个, 编码3 288个蛋白, 与UniProtKB/Swiss-Prot数据库匹配值为40%;与银耳属的其它种相比, 银耳密码子第三位碱基特别偏爱以G或C结尾。邓优锦等[38]对9个银耳栽培菌株和7个野生菌株进行了全基因组重测序, 其线粒体基因组大小在35 104~49 044bp, GC含量为37.6%~38.2%;16个线粒体基因组均包含有14个保守的蛋白编码基因, 各一个大小亚基rRNA和数量不同的tRNA基因。各线粒体基因组的内含子含量为6~13个, 总计检测到19个不同的内含子, 利用内含子的多态性设计了8对特异性分子标记, 检测结果为不同来源的36个菌株为同一品系, 表明这些菌种厂的种质资源单一, 遗传背景狭窄。
8 展望
银耳是非常珍贵的药食用菌, 已作为营养保健食品、休闲方便食品、食品添加剂、护肤化妆品和环境保护等方面得到广泛应用, 其商业价值和市场潜力较大。银耳的生活史上具有酵母状的分生孢子, 并因银耳无食副毒作用, 银耳孢子已成为理想的遗传转化受体, 用CaMV 35S、灵芝gpd-Gl、香菇gpd-Le、双孢蘑菇gpd、内源gpd等启动子调节, 终止子用NOS、GUS作为报告基因, hph作为选择标记基因, 已成功转化了多个外源基因至银耳芽孢中。银耳的基因克隆和分子标记等也取得了一些进展。伴随着生活水平的提高, 人们对转基因的食用性安全也非常关注, 在棉籽壳栽培银耳中已检出35S和NOS基因的特异片段, 未检到转基因棉花外源基因Cry1A的特异片段[39], 也应重视银耳的转基因食用安全性研究。截止到2017年6月21日, 在NCBI数据库中有关银耳的数据, 登记的基因组数据为1个, 156条核苷酸 (DNA和RNA) 序列, 227个蛋白质序列, 3个功能基因, 6个分子系统发育和种群的研究;香灰菌是银耳的生伴生菌, 而香灰菌的的分子生物学研究报道核苷酸 (DNA和RNA) 序列只有25条, 22个蛋白质序列, 1个分子系统发育和种群的研究。相对其它作物和食用菌的研究来讲, 银耳的分子生物学研究还需加强;也应开展银耳菌和香灰菌伴生关系的分子研究, 从分子水平揭示二者的遗传和进化关系, 进一步为银耳的育种和生产奠定理论基础。随着分子生物学技术和生物信息学的发展, 银耳菌和香灰菌基因组信息的不断丰富, 更多的基因功能被注释, 培育出更多的优质银耳新品种, 对银耳的种质资源开发和生产应用具有重要意义。
参考文献
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