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Abstract：ANT (AINTEGUMENTA) gene family is a plant-specific transcription factor, which contain two highly conserved AP2 domain.However, the other regions of amino acid sequences were changeable.It is found that ANT genes, belonging to AP2/EREBP (APETALA2/ethylene-responsive element binding proteins) family transcription factors, are involved in the control of organ growth and development and responses to various external environment stresses in plant.This review focused on ANT protein, genetic characteristics, biological function and regulation mechanisms which to provide some references and inspiration for further research of plant ANT like transcription factor.
Keyword：ANT; Organ size; Growth and development; Transcription factor;
ANT (AINTEGUMENTA) 类转录因子是一类植物特有的DNA结合蛋白, 成员均含有两个AP2结构域 (Licausi et al., 2013) , 隶属于AP2/EREBP (APETALA2/ethylene-responsive element binding proteins) 家族。Elliott等 (1996) 从拟南芥 (Arabidopsis thaliana) 中首次发现ANT基因, 该基因与胚珠发育有关。随后, 该类基因在多个物种中被鉴定出来。此外, 对ANT转录因子研究发现, 其不仅参与调控植物器官生长发育进程 (Nole-Wilson et al., 2010;Chialva et al., 2016;Qiao et al., 2017) , 还参与对非生物胁迫的应答 (Meng et al., 2015a;Meng et al., 2015b) 。本文对ANT类转录因子的蛋白结构特点、基因特征、生物学功能、作用机制等作简要综述, 以期为进一步研究和利用ANT类转录因子提供启示。
1、ANT类转录因子的分类及蛋白特征
AP2/EREBP是植物中重要的转录因子家族之一, 其家族成员至少含有一个由60~70氨基酸组成的AP2结构域 (Nole-Wilson, Krizck, 2000, 孙滨等, 2017) 。根据其序列相似性和AP2结构域的数量, 可将其分为AP2, 乙烯应答因子 (ethylene-responsive factor, ERF) , 干旱应答元件结合蛋白 (dehydration-responsive element binding protein, DREB) , RAV (related to ABI3/VP1) 和Soloist (Licausi et al., 2013) 五个亚族。其中ERF和DREB亚族仅含有一个AP2结构域;RAV亚族除含有一个AP2结构外, 还含有一个植物特有的B3结构域;而AP2亚族含有两个AP2结构域。此外, 根据前、后模体区域和AP2结构域的氨基酸序列差异可将AP2亚族分为eu AP2组和ANT组 (图1) 。ANT类转录因子的蛋白序列均包含五个部分, 分别为前模体区域 (pre-domain region) 、AP2结构域1 (R1) 、连接区域 (linker region) 、AP2结构域2 (R2) 和后模体区域 (post-domain region) , 其中连接区域氨基酸残基数目较为保守 (约为30个氨基酸残基) , 前模体区域位于C端, 而后模体区域则位于N端 (图1) 。eu AP2组在后模体区域中含有micro RNA172 (mi R172) 的结合位点, 而ANT组却未发现该类位点的存在;eu AP2组与ANT组在两个AP2结构域 (R1和R2) 的氨基酸组成上也有所不同, ANT组R1中包含一个由10个氨基酸组成的eu ANT1基序 (NSC[K/R][K/R]EGQ[T/S]R) , 同时R2中有一个氨基酸插入, 而eu AP2组中不包含此基序。进一步分析发现, 根据前模体区域序列长度差异可将ANT组分为eu ANT亚组和basal ANT亚组。eu ANT亚组成员具有较长的前模体区域 (127~307 aa) , 且在该区域中包含三个插入基序, 分别为eu ANT2 (WLGFSLS) 、eu ANT3 (PKLED-FLG) 和eu ANT4 (TFGQR) , 而basal ANT亚组成员的前模体区域较短 (44~81 aa) , 且不包含3个插入基序 (Kim et al., 2006) 。ANT类转录因子的蛋白氨基酸长度介于300~700 aa, 如拟南芥中氨基酸长度最短的为415 aa (At AIL1) , 最长的为604 aa (At AIL6) , 且均含有两个高度保守的AP2结构域 (图2) , 如表1所示, 不同物种中R1的序列相似介于76.49%~88.22%之间, R2的序列相似性介于为65.86%~94.77%之间。进一步分析发现, 该结构域中包含两个极为保守的序列元件 (YRG元件和RADY元件) 。YRG元件含有由19~22个氨基酸残基组成的极碱性保守YRG模体;RAYD元件由42~43个氨基酸残基组成, 其中包含由18个氨基酸残基组成的极度保守的核心序列, 该序列内部可形成两亲性的α-螺旋, 参与其他转录因子的相互作用 (Okamuro et al., 1997) 。虽然具有高度保守的AP2结构域, 但其他区域的氨基酸序列存在差异, 暗示AP2结构域的重要性以及ANT组成员功能的多样性。ANT类转录因子成员的两个结构域均参与DNA的识别且缺一不可, 因此该家族成员具有较长的识别位点GCAC (A/G) N (A/T) TCCC (A/G) ANG (C/T) (Nole-Wilson, Krizek 2000;Krizek, 2003) 。
图1 AP2类转录因子分类结构图 (Kim et al., 2006)
图2 拟南芥ANT类转录因子AP2保守结构域
表1 拟南芥、水稻、大豆、大白菜和番茄ANT蛋白及AP2结构域类型
2、ANT类转录因子基因特征
ANT类转录因子以基因家族的形式存在于多种植物中。在拟南芥中该家族主要包括ANT以及ANT like基因, 分别为ANT, AIL1 (ANT like 1) , AIL2/BBM/PLT4 (ANT like 2/Baby Boom/PLETHORA4) , AIL3/PLT1 (ANT like 3/PLETHORA1) , AIL4/PLT2 (ANT like 4/PLETHORA2) , AIL5/PLT5 (ANT like 5/PLETHORA5) , AIL6/PLT3 (ANT like 6/PLETHORA 3) 和AIL7/PLT7 (ANT like 7/PLETHORA 7) 。如表2所示, 拟南芥中含有8个成员 (Horstman et al., 2014) , 水稻 (Oryza sativa) 中含有10个成员 (Rashid et al., 2012) , 大豆 (Glycine max) 中含有8个成员 (魏海超等, 2015) , 番茄 (Solanum lycopersicum) 中含有5个成员 (杨蔚然, 2014) , 大白菜 (Brassica rapa) 中含有15个成员 (丁谦, 2015) 。染色体分布分析结果显示, ANT类转录因子不均匀分布于各物种染色体上, 如拟南芥仅在1、3、4和5号染色体上有分布, 水稻仅在2, 3, 4, 6, 8, 11号染色体上有分布, 大豆仅在1, 3, 4, 5, 6, 10, 11, 17号染色体上有分布, 番茄中仅在2, 4, 5, 7和11号染色体上有分布, 大白菜中仅在1, 2, 3, 6, 8和10号染色体上有分布。此外, 大部分ANT家族基因均含有内含子, 例如拟南芥、水稻和大白菜ANT类转录因子中含有6~8个内含子, 大豆和番茄中则含有7~8个内含子。
3、植物ANT类转录因子生物学功能
近年的研究发现, ANT类转录因子不仅参与调控植物生命进程, 如花、叶、根、种子的发育等, 还参与植物对盐胁迫的响应以及植物叶片衰老进程的调控 (表3) 。
3.1、ANT类转录因子参与调控花器官发育
花是植物重要的生殖器官, 其发育进程直接影响着植物的生长和繁衍 (许智宏, 刘春明, 1998) 。近年来在拟南芥中的研究发现, ANT类转录因子是花发育进程中的重要调控因子, 如参与调控花形态建成、胚珠发育和花器官大小发育等进程 (Mizukami, Fischer, 2000;Krizek, 1999;Krizek, 2009) 。研究表明, 拟南芥ANT类转录因子除参与调控花分生组织分化的起始和形态建成外 (Krizek, 2011a) , 还对花瓣表皮细胞特征发生起决定性作用 (Krizek, 2009) 。例如, 通过对拟南芥ANT缺失突变体的研究发现, ANT基因通过抑制C类功能基因 (AGAMOUS, AG) 在萼片、花瓣、心皮和雌蕊中的表达而导致花形态异常 (Elliott et al., 1996) 。此外, ANT基因在调控胚珠与雌配子体的发育中扮演着重要的角色 (Klucher et al., 1996) 。强ANT突变体的胚珠不能形成种皮或雌配子体, 而弱ANT突变体含有内外两层表皮, 但仍不能产生功能性的雌配子体 (Klucher et al., 1996;Elliott et al., 1996;Mizukami, Fischer, 2000;赵奇等, 2005) 。最近的研究发现, ANT类转录因子在花器官大小、位置及花瓣数目发育进程中起重要作用。如过表达At ANT基因的矮牵牛 (Petunia hybrida) 植株花器官变大, 而降低矮牵牛Ph ANT基因的表达量会使花器官减小 (Manchado-Rojo et al., 2015) 。另外, ANT-like基因的突变体植株花器官发育异常, 如ail5 (ant like 5) 、ail7 (ant like 7) 双突变拟南芥植株在花器官位置、瓣膜融合程度以及花瓣数量等方面与任意单突变体植株相比变化显着;在ant、ail5双突变体植株中花瓣发育异常, 且常被花丝取代且变小;ant、ail7双突变体植株中心皮数目增加, 瓣膜融合以及顶端分生组织发育受阻。三突变体和双突变体具有相似的效应, 虽然ant、ail5、ail6三突变体与ant、ail6双突变体表型相似, 但与野生型以及ant、ail5或ant、ail7双突变体相比却存在很大的偏差 (Krizek, 2015) 。
生长素 (auxin) 作为迄今为止唯一能够极性运输的激素, 参与调控植物生长发育进程, 近年来, 相关实验表明生长素在花器官发育过程中起关键作用, 尤其是生长素与基因相互协调参与调控花器官发育 (Arrom, Munné-bosch, 2012;Silva et al., 2014) 。例如, Krizek (2011b) 研究发现生长素通过ANT转录因子调控植物花器官的位置和数目。进一步分析发现, ANT、AIL1、AIL5、AIL6和AIL7与花器官发育密切, 但功能各有不同, 其中ANT主要调控花原基的起始发育, AIL5、AIL6和AIL7则主要与花序发育相关, 但AIL7仅在分生组织中生长素密集的中心区域表达。ANT、AIL5、AIL6基因的单缺失突变体植株的花器官发育正常, 而ANT、AIL6的双缺失突变体植株花器官出现缺陷, 同时生长素极性运输受阻, 而外施萘基邻氨甲酰苯甲酸 (naphthylphthalamic acid, NPA) 可使AIL6缺失突变体植株的花序分生组织的起始发育终止, 这表明, ANT、AIL5、AIL6基因通过与生长素相互协调来调控花序分生组织的起始发育。此外, 拟南芥雌蕊中生长素内稳态失调导致ANT缺失突变体植株的雌蕊缺陷, 而通过外施萘基邻氨甲酰苯甲酸 (naphthylphthalamic acid, NPA) 可以改善部分顶端融合缺陷 (Krizek, 2015) 。
表2 拟南芥、水稻、大豆、大白菜和番茄ANT基因在染色体上的分布
3.2、ANT类转录因子参与调控果实发育
ANT转录因子在调控植物果实的生长发育方面具有重要作用。Dash和Malladi (2012) 研究发现, ANT基因 (Md ANT1和Md ANT2) 在苹果 (Malus×domestica) 果实发育的不同阶段均有表达。且Md ANT1和Md ANT2的表达强度与细胞周期相关, 细胞增殖阶段该类基因的表达增强, 而在细胞间期时表达量则会急剧下降, 并在果实发育后期保持着较低的表达水平, 这表明ANT基因参与果实发育过程。此外, Md ANT1和Md ANT2基因在果型大小存在差异的两个苹果品种 ('Gala'和'GS') 中表达也存在差异, 与'Gala'相比, 'GS'中Md ANT1和Md ANT2基因具有较高且持久的表达, 因而果型也更大, 这表明, ANT家族基因在果实大小发育中起作用。最近的研究还发现, 番茄Sl AIL1-2基因在番茄果实发育的不同阶段均有表达, 其中幼果期表达量最高, 这表明该基因与番茄果实的早期发育有关 (杨蔚然, 2014) 。
表3 不同物种ANT基因的生物学功能
3.3、ANT类转录因子参与调控根的发育
根是植物体的重要器官, 除固持植物体, 吸收水分和土壤养分向地上部运输外, 还可将地上部光合产物运送至根部 (张鋆鋆等, 2016) 。PLT (PLETHORA) 基因又名AIL (AINTEGUMENTA-LIKE) 基因, 近来研究发现, 该类基因在在调控植物根发育具有重要作用 (Scheres, Krizek, 2017) 。如PLT1/AIL3、PLT2/AIL4、PLT3/AIL6、和BBM/PLT4/AIL2在维持根分生组织细胞分裂和阻止细胞分化方面起作用 (Santuari et al., 2016) 。拟南芥植株在根生长率和根分生组织细胞数目等方面较野生型植株显着减少。而与plt1和plt2单突变体和野生型植株相比, plt1、plt2双突变拟南芥植株的根生长速率和根分生组织细胞数目明显减少 (Aida et al., 2004) 。近来研究发现, PLT3、PLT5和PLT7基因在植物侧根发育中也扮演着重要角色。plt3、plt5、plt7三突变体植株的侧根原基数目和密度较野生型植株显着增加, 但其形态发生异常 (Du, Scheres, 2017) 。另外, 白杨 (Populus trichocarpa) ANT类转录因子Pt AIL1在根原基的形成过程中表达量升高, 表明该基因可能参与植物根发育过程。过表达Pt AIL1的转基因植株表现出不定根数目增多的表型, 相反其干扰植株的不定根数目减少。进一步微阵列分析发现, Pt AIL1可能通过调控包括AGL6 (AGAMOUS-LIKE6) 和MYB36 (Myeloblastosis 36) 在内的15个与根发育相关的基因的表达而促进不定根的早期发育 (Rigal et al., 2012) 。此外, ANT类转录因子对于植物根构型的形成具有重要作用。根构型是指根系的结构及空间造型, 影响根构型的因素较多 (营养、水分和其他农艺措施等) 。例如, PRD (phosphate root development) 基因在根尖组织中特异性表达, 说明该基因可能参与调控根系发育及根构型的改变。缺磷土壤环境下, prd突变体根系发育受阻, 而其互补植株的根系表型和根构型与野生型相似。此外, 野生型植株和突变体植株在磷元素的吸收、阴离子的富集以及根中特异基因 (Phosphate Transporter 1:1 (PHT1;1) 、Phosphate Transporter 1:4 (PHT1;4) 、Acyl Carrier Protein 5 (At ACP5) ) 的表达等方面无异。进一步分析发现, PRD基因通过控制根的生长延伸参与调控根构型 (Camacho-Cristóbal et al., 2008) 。
3.4、ANT类转录因子参与调控种子的发育
在多种植物中, 种子的大小是决定种子萌发、幼苗活力的重要因素之一, 而且对于提高种子抗逆性也具有重要作用 (朱伟等, 2012) 。已有的研究表明, ANT类基因在调控种子大小发育中起重要作用。例如, Mizukami和Fischer (2000) 的研究发现, 过表达拟南芥ANT基因的转基因植株 (拟南芥和烟草) 均形成较大的种子。Confalonieri等 (2014) 利用根特异性表达启动子 (unknown seed protein, USP) 在蒺藜苜蓿中过表达ANT基因不仅导致转基因植株种子变大, 而且还使其萌发能力增强。此外, 过表达大白菜Br ANT2基因的拟南芥植株种子变大和千粒重增加 (丁谦, 2015) 。
3.5、ANT类转录因子其他方面的作用
ANT基因参与调控植物叶片衰老发育进程。Feng等 (2016) 对拟南芥ANT基因研究发现, 其过量表达植株表现出叶片衰老延迟的表型, 而其功能缺失突变体则表现出叶片早衰的现象。此外, 拟南芥ANT基因在侧枝器官的发育方面也扮演着重要的角色。研究表明, ANT与FIL (FILAMENTOUS FLOWER) 基因结合上调近轴端识别基因PHB (PHABULOSA) 的表达促进器官的极性形成, 而且ANT与FIL同样会上调花发育相关基因APETALA3的表达从而促进侧枝器官原基的发育 (Nole-Wilson et al., 2005) 。Boutilier等 (2002) 对油菜 (Brassica napus) Bn BBM (Brassica napus BABY BOOM) 基因研究发现, 过表达该基因的拟南芥植株幼苗出现愈伤组织类似物, 且外植体不经植物激素诱导也能继续分化。Srinivasan等 (2007) 进一步研究发现BBM基因参与调控植物细胞分裂增殖进程。已有的研究表明, 植物BBM基因参与调控植物的无配生殖。Bui等 (2017) 从水蕨 (Ceratopteris richardii) 中分离到了1个与拟南芥ANT同源的基因Cr ANT。过表达Cr ANT基因能够促进水蕨植物无糖供给条件下的无配生殖。
3.6、ANT基因在植物响应非生物胁迫中的作用
干旱、高盐、高温等非生物胁迫对植物生长发育具有重要影响。为了更好的适应环境, 植物通过各种复杂路径响应胁迫信号。最近的研究发现, 拟南芥和番茄的ANT基因在参与响应胁迫过程扮演着重要角色。例如, 杨蔚然 (2014) 研究发现, 番茄Sl AIL1-2基因启动子区含有热胁迫响应顺式作用元件 (HSE) 和水杨酸响应顺式作用元件 (TCA-element) , 这表明, Sl AIL1-2可能参与调控番茄热胁迫反应应答。Meng等 (2015a) 研究发现, 过量表达ANT基因的拟南芥植株抗旱能力增强, 说明该基因正向调控拟南芥对干旱胁迫的耐受性。此外, Meng等 (2015b) 对拟南芥ANT基因研究发现, 其过表达株系的幼苗在高盐胁迫中高度敏感, 而功能缺失突变株则表现出明显的抗盐表型, 说明其负调控拟南芥对盐胁迫的耐受力。
4、植物ANT类转录因子作用机理
ANT类转录因子可与多种基因互作共同参与调控植物器官大小发育进程。Mizukami和Fischer (2000) 提出了植物ANT基因调控器官大小发育的模型, 如图3所示, 当植物接受外界信号后, 生长调节因子调控ANT基因表达, 促进植物分生组织分化能力增强, 进一步增强或减弱下游生长调节因子和细胞周期调节因子的表达而调控植物细胞数目或大小的增加从而控制植物器官发育。其中ARGOS (auxin-regulated gene involved in organ size) 和生长素响应因子 (auxin response factor 2, ARF2) 是ANT基因上游主要的调控因子。例如, Hu等 (2003) 研究发现, 拟南芥ARGOS基因参与调控ANT介导的器官发育进程。At AGROS的过量表达植株器官增大, 而其功能缺失突变体植株器官变小。此外, At ANT基因的突变会导致At ARGOS过表达植株器官减小。这表明, At ARGOS基因通过调控ANT的表达, 而进一步影响下游细胞生长、细胞增殖等相关基因的表达而调控植物器官发育。Meng (2015a) 等研究发现, At ARF2可与At ANT基因启动子区特异性结合而负调控At ANT基因的表达, 而At ANT基因又进一步负调控脱落酸途径关键基因COR15a (cold-regulated15a) 参与调控植物种子大小发育。另外, At ARF2还可通过调控At ANT基因参与植物叶片衰老进程 (Feng et al., 2016) 。
图3 ANT类转录因子调控器官大小发育模型
ANT类转录因子协同下游生长调控因子通过调控细胞的数目或大小参与植株器官生长发育进程, 同时也参与调控细胞分化 (Kuluev et al., 2015;Chialva et al., 2016) 。D型细胞周期蛋白 (cyclin D, CYCD) 是植物细胞周期G1/S转化的关键调控因子 (Dewitte, Murray, 2003) , 同时也是ANT基因调控的潜在靶基因 (Anastasiou, Lenhard, 2007;Wu et al., 2011) 。例如, At ANT的异位表达可延长拟南芥植株的叶片和花蕾中CYCD3;1的表达 (Mizukami, Fischer, 2000) 。苹果ANT基因 (Md ANT1和Md ANT2) 在果实发育不同阶段中均有表达且与细胞周期相关基因 (A/B型细胞周期蛋白, 细胞周期素依赖性激酶) 的表达变化相互对应 (Dash, Malladi, 2012) 。Randall等 (2015) 研究发现, 在白杨中细胞分裂素促进ANT与CYCD3;1基因的表达而共同参与调控根器官的次生生长。此外, AILs (ANT-like) 通过与BBM (BA-BY BOOM) 和HDG (HOMEODOMAIN GLA-BROUS) 基因相互作用而调控植物器官发育。在该调控网络中, AILs促进细胞分裂而HDGs加速细胞的分化, BBM则与HDG共同调控一些靶基因, 但同时三个基因之间又相互调控彼此的表达 (Horstman et al., 2015) 。最近的研究还发现, LFY (LEAFY) 是调控植物从分枝到开花的转变的重要转录因子。而ant、ail6双突变体在分生组织特性转换过程中存在延迟, 同时ANT和AIL6/PLT3会结合在LFY的启动子上调控LFY的表达, 即ANT/AIL6共同促进LFY的诱变过程, 促使拟南芥从分枝到开花转变的发生 (Yamaguchi et al., 2016) 。总之, ANT类基因作为一种转录因子, 可与其他转录因子相互作用或者调控下游靶基因表达而影响植物生长发育。
5、总结与展望
ANT是一类植物特异性转录因子, 广泛存在于不同的植物体中。近年来, 人们对ANT基因的功能、作用机制等进行了一系列的研究, 其不仅参与调控植物器官发育, 还对干旱、盐、高温胁迫应答。这些研究结果, 为人们通过生物技术手段提高作物产量和植物耐受性提供了新的思路。但目前的研究仍存诸多不足。第一, 关于ANT家族成员的研究仅在拟南芥、水稻、白杨等少数物种中展开, 在更多物种中开展关于ANT转录因子家族成员鉴定是未来研究的重点之一。第二, 同一物种中ANT家族成员的功能尚未全部分析, 是否存在新的功能还不得而知, 这就要求对更多物种的基因家族成员进行功能分析。第三, 关于ANT转录因子是如何介导下游标靶基因表达及其参与的信号转导通路的研究甚少, 这也是今后研究的热点问题。
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