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摘要：农产品质量安全是关系到国计民生的大事, 也是全世界共同关注的焦点问题。农产品质量安全检测技术是农产品质量安全的重要保障。分子生物学检测技术较传统检测技术具有灵敏度高、特异性强、快速和便捷等优点。基于此, 本文综述PCR法、ELISA法、分子免疫技术、酶抑制法和生物传感器等现代分子生物学检测技术在农兽药残留、真菌毒素、重金属残留和细菌污染等农产品质量安全危害因子检测中的应用, 并对其研究应用现状和发展趋势进行评述。
关键词：农产品; 质量安全; 分子生物学检测技术;
中国是一个人口大国, 也是一个农业大国。农产品质量安全是关系到国计民生和国家可持续发展的重大问题。随着科学技术的快速发展, 农业生产和加工逐渐向产业化和工业化发展, 由此而引发的农产品质量安全问题不容忽视, 农产品质量安全检测技术的研究与发展显得尤为重要。目前, 我国已逐步建立起农产品质量安全检测网络, 极大地推动了我国农业经济发展[1]。尽管如此, 农产品质量安全仍然是公众及媒体热切关心的话题, 也面临着极大的挑战。农产品质量安全检测技术是保障和监控农产品质量安全的重要技术支撑, 也是关键的制约因素。因此, 农产品质量安全检测技术提高及检验检测体系能力建设显得更为迫切, 将先进技术应用于农产品质量安全检测, 建立各种快速、准确、可靠的检测方法, 提高检验检测效率, 有效保障农产品从生产到进入市场全过程安全, 是农产品质量安全检测工作提高和发展的必经之路, 也是夯实农业质量安全工作的基础。
农产品质量安全检测技术的检测对象主要是针对影响农产品质量安全的农产品环境指标 (包括土地指标、大气指标、水质指标等) 中农兽药、重金属等化学危害因子以及微生物、寄生虫、生物毒素等生物危害因子[2]。然而, 由于检测对象种类繁多, 组成结构复杂, 动态、痕量、浓度波动范围大, 并且样品基质复杂, 干扰因子多, 使得农产品质量安全检测技术研究具有复杂性[3]。传统化学检验检测技术因具有费工时、耗资大, 常伴有试剂、溶媒污染, 同时破坏对象物原有化学结构等问题, 已不能满足于现代农产品质量安全监测控制发展的需求, 而形态学观察、生理生化、酶抑制法、免疫分析法和培养基筛选等检测手段存在灵敏度低、假阳性、特异性差和效率低等明显缺点。近年来, 随着生命科学与其交叉学科的发展, 以及生物信息学、计算机技术的应用, 分子生物检测技术作为一种基因水平的检测技术, 因其具有快速灵敏、特异性好、响应快等优点而在农产品质量安全方面逐渐得以应用, 成为保障农产品质量安全不可或缺的重要技术支撑。针对分子生物检测技术的研究和发展成为新时期农产品质量安全的战略制高点之一, 也备受农产品质量安全领域的关注与重视。
1 农产品质量安全检测技术发展中存在的问题
1.1 农兽药残留及农产品检测技术存在局限性
我国农产品质量安全工作在检测技术上存在着很大问题。近年来, 我国农产品质量安全检测技术正在提升, 根据相关研究数据表明, 我国农产品农兽药检测技术水平已有极大的提高, 农兽药残留及多项药物与添加剂等均可检出, 并且制定了确定的检验检测标准。快速检测技术也在市场中获得了很大的成功, 市场占比逐年提高。然而, 尽管如此, 我国农产品质量安全工作在检测技术上仍然存在很多问题。例如, 农兽药残留方面仍有许多种类无法进行检测;农产品品质、内源营养物及产地环境污染物质无法进行检测;我国检验检测设备主要依靠进口而缺乏自主研制研发的检测仪器与设备, 从而无法具有针对性的进行检测;现有快速检测技术产品的灵敏性差, 快检仪器设备稳定性低, 存在着跟多问题等。
1.2 农产品质量安全风险评估缺少检测数据
我国对农产品质量安全检测工作缺少风险评估数据。就风险评估技术而言, 我国对农产品中存在的化学物质进行了检测, 主要建立了阶梯式的暴露评估和累积性的膳食暴露评估2种风险评估方式。然而, 我国, 农产品质量安全风险评估基础数据不够完善, 毒理学、危害因素本底含量等方面的数据严重缺乏, 无法满足对农产品质量安全风险评估的市场需求。真菌毒素对农产品污染的风险评估便急需数据支撑。真菌毒素 (Mycotoxin) 是真菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物, 毒性非常高, 对农作物及其产品及饲料等植物源性产品都造成了污染, 对人类和动物同样有害。目前已发现的真菌毒素有200余种, 可通过被其污染的谷物和饲料喂养的动物性产品 (如奶、肉、蛋等) 进入食物链, 进而成为农产品质量安全的危害因子危害人类健康。真菌毒素的共同毒性主要表现在可导致DNA损伤和细胞毒性两方面[4]。黄曲霉素、伏马霉素、棕曲霉毒和玉米烯酮等许多真菌毒素一般在较低水平下的慢性毒性比其急性毒性更值得关注。究其原因在于某些真菌毒素确定有潜在致癌性, 媒体对其进行了广发报道, 但是因为食品中真菌毒素的完全去除是不可能的, 所以应用快速可靠的毒素检测技术将其控制在对健康不构成威胁的安全水平内就显得尤为重要。然而, 分子生物检测技术作为一种快速可靠、灵敏性强的检测技术因仍然停留在发展阶段而尚未被纳入风险评估的内容中。因此, 我国农产品质量安全风险评估工作缺少大量确实的数据, 评估的样板严重缺乏[5]。
1.3 农产品产地环境溯源方面缺乏技术提升
近些年, 我国在产地溯源技术上取得了一定的成就, 建立了稳定的同位素法、DNA标记法及近红外反射光谱法等等多项产地溯源技术和方法。然而, 我国现有的溯源体系仅限于产地信息记录方面, 缺乏与产品品质、加工等相关的溯源技术, 亟待形成完整的产地溯源体系。其中, 重金属作为一类有毒且难以降解并具有潜在危害性的农产品产地环境污染物而备受关注。重金属污染具有隐蔽性、不可逆和长期性, 在农畜产品中均存在不同程度的残留。现已知具有很大毒性的重金属至少20种, 其经食物链的生物放大作用侵入人体, 长期积累则导致各种“公害病”乃至癌症等, 是影响人类健康的严重污染物质。
2 分子生物学检测技术在农产品质量安全中的应用现状
2.1 分子生物学检测技术在农产品农兽药残留检测中的应用
目前, 用于农兽药残留的主要快速检测技术为化学、免疫学及酶抑制技术。化学检测技术主要用于有机磷的检测, 但是该方法仅限于土壤、果蔬中的有机磷检测且灵敏度差。分子生物检测技术 (包括酶联免疫技术、RT-PCR技术、生物传感器、基因差异显示技术、生物芯片和基因探针等) 以其高灵敏性和特异性而成为国内外农产品质量安全研究的热点。作为分子生物检测技术中发展最为迅猛的酶联免疫技术 (ELISA) 和PCR技术已逐渐成为农兽药残留检测中最快速有效的主流检测方法, 也是色质谱之外特异性最强的方法。
酶联免疫技术 (ELISA) 是由分子免疫技术结合现代测试手段而建立的一项微量检测技术。因其灵敏性强, 特异性好而成为农兽药残留污染物检测中应用最广的分子生物学技术[6]。斑点酶联免疫吸附试验 (DOT-ELISA) 、亲和素生物素系统ELISA (ABC-ELISA) 、双夹心酶联免疫吸附试验 (DS-ELISA) 等则是在其基础上而衍生出来的检测方法。由其研发制成的试剂盒在食品、蔬果和产地环境中已被大量应用于农兽药残留的测定分析, 可检测包括有机磷、有机氯、氨基甲酸酯类在内的大量农药, 其中硫和磷含量的检测灵敏性和特异性最佳。Singh[7]等应用ELISA试剂盒对12个农场区域的茄子样品中的硫的含量进行了测定, 与气相色谱法比较之后发现二者之间的相关性达到了0.98。除此之外, 用抗体磁颗粒ELISA法对水中的西维因进行检测, 测定范围为0.22~0.25μg/L, 检测结果与液相色谱法的检测结果同样表现出了极好的相关性。
2.2 分子生物检测技术在农产品真菌毒素检测中的应用
目前, 传统的真菌毒素检测方法基本都必须经过前增菌、平板选择性分离、生物化学和血清学分型鉴定4个步骤。整个检测工作量大、周期长、成本高, 且依靠主观判断, 所以导致检测数据准确性低, 灵敏性差。因此, 作为现代快速检测技术的分子生物学技术在真菌毒素检测中的应用则备受关注。目前, 应用于真菌毒素检测的分子生物学检测技术主要包括有两种方法, 分别为包括酶联免疫、免疫扩散法、免疫传感器法及免疫色谱法等在内的免疫学方法, 以及以核酸为研究基础的分子生物学方法, 后者则主要有核酸探针法和PCR法。PCR法因其高灵敏性和特异性而更具优势, 已成为真菌毒素检测的优势技术。PCR (全称聚合酶链式反应) 技术是一种在体外模拟生物体细胞内DNA复制过程而对特定DNA序列进行快速扩增的分子技术。其具有快速、特异性强、灵敏性高的优点, 是分子生物学领域的又一次革命性的突破, 其发展与更新速度极快。随着交叉学科的发展, 分子生物学技术有了更多元化的发展, 新的PCR检测技术方法层出不穷。例如:PCR-基因扫描、等位基因特异性扩增技术 (Allele-specific PCR) 、套式引物PCR技术、竞争PCR (C-PCR) 技术和反转录PCR (RT-PCR) 技术等。
近些年, PCR技术已广泛应用于农产品中真菌毒素的快速检测。Babu等[8]建立了免疫磁珠捕获Real Time PCR技术对黄曲霉毒素B1进行了检测, 分别利用单克隆抗体直接夹心和多克隆抗体间接夹心免疫PCR检测, 结果表明单克隆抗体捕捉的直接夹心法是最佳方法, 其检测范围为0.1~10.0μg/L, 相关性为0.97, 效能为99.5%, 这就为应用免疫-PCR检测农产品中低分子抗原奠定了一定的基础。He等[9]则建立了免疫-PCR技术用于检测牛肉、牛奶及生鸡蛋中的蓖麻毒素, 结果表明牛肉、牛奶、生鸡蛋的检测限, 免疫-PCR技术分别为100、10、10 pg/m L, 而传统ELISA法分别为103、103、104 pg/m L。Rajkovic等[10]对含1%牛血清蛋白 (BSA, Bovine Serum Albumin) 的磷酸盐缓冲液 (PBS, phosphate buffer solution) 及半脱脂牛奶中的肉毒杆菌神经毒素 (botulinum neurotoxins, Bo NT) , A、B分别采用LISA和定量免疫-PCR法进行了检测, 结果表明Bo NT/A的检测限用ELISA检测分别为15、30 ng/m L, 检测均为0.09 ng/m L;Bo NT/B的检测限用ELISA检测分别为15、30 ng/m L, 用定量免疫-PCR分别为0.37、0.75 pg/m L。Leenalitha等[11]采用了免疫-PCR信号放大技术对牛奶、柠檬奶油派、金枪鱼沙拉及火鸡中的金黄色葡萄球菌肠毒素分别进行了检测, 其检测限均低至7.5 fg/m L。
2.3 分子生物检测技术在产地环境及农畜产品中残留重金属检测中的应用
目前实验室常用的重金属检验检测方法主要有:石墨炉原子吸收光谱法, X射线荧光光谱法和ICP-AES等, 虽然能准确测量出样品中单个金属总量, 但是耗时多, 预处理过程复杂, 测量结果无法反应出重金属氧化还原状态的变化或其状态演变的信息。进而对重金属污染普查和风险评估工作造成很大的不确定性。近些年, 国内外对重金属快速检测技术的研究很多, 其中研究较为成熟且已应用的有免疫学检测技术、酶抑制法以及生物传感器技术。免疫学检测技术已成功应用于水质样品中铟 (Ⅲ) 、汞 (Ⅱ) 、镉 (Ⅱ) 、铅 (Ⅱ) 和铀 (Ⅵ) 等的检测。重金属酶抑制法指的是利用脲酶抑制法对土壤和水质样品中的汞的测定, 但也集中在环境中水样及液体样本的快速检测。针对固体样品中重金属的快速检测, 目前研究并可应用的则是生物传感器技术。利用lac Z和ars D基因在大肠杆菌重组质粒中的表达可制成具有高灵敏度的生物传感器, 可用于检测重金属亚锑, 结果表明亚锑盐的检测限为1×10-15 mol/L。基于光合系统Ⅱ的原理, 利用重金属壳模拟叶绿素分子中的Mg2+反应引起p H值变化的性质, 研发制成了生物传感器, 将藻细胞固定在琼脂 (浓度2%) 中, 由p H值测定值的变化来测定重金属铬和镉的含量。
3 展望
农产品质量安全是关系到国计民生的大事, 因此有关农产品质量安全中的农产品品质分析、质量控制和产地环境检测都对检测技术提出了更多更高的要求。近几年, 以ELISA法、PCR法、生物传感器及免疫学检测技术等为代表的分子生物学技术凭借其无可比拟的高灵敏性在农产品质量安全及农业环境检测中都得到了迅猛的发展, 已获得了国际范围内的广泛关注与研究, 检测速度、检测范围和检测限都得到了极大的提升, 且正在向便携、高通量、具“类特异性”的方向发展, 因此分子生物学技术应用于农产品质量安全检测已成为发展的趋势。
虽然分子生物学检测技术在农产品质量安全检测上具有广阔的发展前景, 但同时也存在着一定的局限性。例如, 目前酶抑制法、免疫分析技术还在定性和半定量的发展阶段, 检测室常规检测中还未完全取代常规气相色谱和高效液相色谱的方法;ELISA法虽然在农兽药检测中高效、快速、灵敏, 但由于其抗体制备较为困难、缺乏共用试剂且还不适于多项残留的分析, 所以未完全应用于农产品质量的检测。因此, 密切关注和了解国内外最新研究发展动态, 尽可能缩短最新技术在农产品质量安全检验领域中的应用周期, 把科学技术转化为生产力。在检测室现有传统检测技术的基础上, 结合多种分子生物学技术运用于农产品质量安全检测, 形成特异性强、灵敏性高、快速、便捷和高效的农业质量安全检测体系将会是今后研究的重要发展趋势。
参考文献
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[2]李君, 贺志红, 张代红, 等.农产品安全检测技术的发展和应用[J].农业与技术, 2017 (24) :163.
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[4]宋宏新, 马娜.食品中病原微生物快速检测方法研究进展[J].食品研究与开发, 2005 (2) :127-130.
[5]刘艳华.科技创新与农产品质量安全的相关思考[J].现代农业, 2016 (12) :54-55.