参与脊髓兴奋调制的中间脊髓神经元生理特性

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　　摘要：脊髓中有许多中间神经元参与躯体运动的调节作用, 这些神经元为中小型神经元, 其胞体位于脊髓中央灰质第VII层、VIII层和中央管细胞群 (X层) , 其细胞的静息膜电位为-65.1±1.5m V, 这些神经元没有自发放电, 但当一个去极化电流脉冲注入细胞可引起神经元的兴奋, 发放动作电位。FPL64176 (20nmol/L) , 一种L型钙通道激活剂, 诱发动作电位的频率增加, 硝苯地平 (nifedipine) (20nmol/L) 阻断这一效应。这有助于理解脊髓中间神经元对躯体运动的调节作用。

　　关键词：脊髓中间神经元; 放电特性; 运动调节;

　　为了清楚脊髓中间神经元在躯体运动发生中的作用, 首先就必须了解参与躯体运动的脊髓神经元的电生理特性, 这些特性在脊髓神经元的兴奋传递及相互调制过程中发挥着重要作用。本研究就是通过使用全细胞膜片钳记录神经元的电活动情况来了解参与脊髓兴奋调制作用的中间脊髓神经元生理特性。

　　1、材料和方法

　　1.1、BAL/c小鼠

　　购买自河南省实验动物中心, FPL64176、nifedipine和其它试剂购买自Sigma公司。

　　1.2、膜片钳记录

　　BAL/c小鼠 (出生后8-15天) 被用氯胺酮 (100mg/kg) 腹腔注射麻醉。脊髓分离手术在小于4°C的人工脑脊液 (ACSF) 中进行。人工脑脊液内含有氯化钠25 m M, 蔗糖188m M, 氯化钾1.9m M, 磷酸二氢钠1.2m M, 硫酸镁10m M, 碳酸氢钠261.5m M, 葡萄糖25m M。分离出的下胸腰段脊髓被用振动切片机 (VT1000S, 德国) 切成300m M厚的脊髓片, 立即放进36°C温暖的ACSF中, 并连续给予95%氧+5%的二氧化碳。温暖的人工脑脊液含氯化钠119m M, 氯化钾1.9m M, 磷酸二氢钠1.2m M, 硫酸镁10m M, 氯化钙1m M, 碳酸氢钠26m M, 葡萄糖10m M, 3%葡聚糖, p H值7.4。脊髓片被放在显微镜下观察和进行电生理记录, 脊髓中间神经元全细胞膜片钳的记录在室温 (20-22℃) 下进行, 实验数据被Axopatch-700B放大器和Digidata1440A数据采集系统 (Axon仪器) 采集, 用p CLAMP10.0软件进行分析。全细胞记录是在电流钳模式进行, 桥式平衡和电容补偿被应用。记录电极 (世界精密仪器公司) , 用1.5mm直径薄壁玻璃微电极拉制 (PC-10, Narishige科学仪器实验室, 日本) , 其电极阻抗约3-6m W。微电极管内溶液含有 (m M) :K-葡糖酸钾135;HEPES10;氯化镁1;EGTA10;氯化钙1;氯化钠6;ATP3;GTP0.3;谷胱甘肽5;蔗糖20。

　　1.3、统计分析

　　实验结果表示为平均值±s.E.M。采用方差分析和Student’st检验进行统计数据比较。P值小于0.05被认为具有显着性差异。

　　2、结果

　　2.1、部位和形态

　　中间神经元多位于脊髓灰质中部VII层、VIII层和靠近中央管 (X层) 附近, 为多极神经元, 直径约5-12m M, 它们是构成躯体运动调节的环路神经元。

　　2.2、神经元的电生理特性

　　稳定的全细胞记录40个中间神经元, 其细胞的静息膜电位为-65.1±1.5m V, 膜电容为63.5±7.5p F, 膜电阻是125.7±8.4m W, 动作电位的幅度82.5±1.4, 阈电位为-45.6±3.0m V。这些神经元没有自发放电, 但当一个去极化电流脉冲 (1s, 0.2-1.0n A) 注入细胞可引起神经元的兴奋, 发放动作电位, 随着刺激强度的增加, 发放动作电位的频率也增加, 放电频率从0.2n A时2.0±1.0Hz增加到1.0n A时29.0±5.1Hz (n=40, P<0.01) 。在灌流液中加入FPL64176 (L-型钙通道激活剂) 后, 神经元的兴奋性增加, 其放电频率平均值从对照组的1.2±0.4Hz到FPL64176 (20nmol/L) 的36.0±4.5Hz。而硝苯地平 (nifedipine, 20nmol/L) 则抑制FPL64176诱导的放电频率增加的反应, 细胞放电频率从36.0±4.5Hz降低至2.7±1.0Hz (P<0.001) 。

　　3、讨论

　　近年来, 关于脊髓神经元局部环路在躯体运动中的调制作用成为研究热点, 其中重要的问题就是产生节奏性运动的发生区域在哪里, 如何识别这一特定区域和清楚哪些脊髓神经元参与运动的调节, 这就需要了解它们的电生理特性和对哺乳动物运动的影响。我们的研究表明中间神经元为中小型神经元 (直径约5-12m M) , 其胞体位于脊髓中央灰质第VII层、VIII层和靠近中央管细胞群 (X层) , 是局部回路神经元, 在神经兴奋传导路径中起连接传递兴奋作用。它们接受感觉神经元传来的神经冲动, 再将冲动传递到运动神经元, 并对运动神经元的兴奋进行调制来协调肢体的运动。L-型钙通道激动剂 (FPL64176) , 主要对心肌细胞局部诱发的钙电流有重要的影响, 而我们的实验发现L一型钙通道功能活动可能参与了脊髓中间神经元对运动的调节过程, 因为这些中间神经元, 在使用FPL64176后表现出L型钙通道电流活动增强现象。一些神经递质如5-羟色胺, 乙酰胆碱等通过上调Ca2+通道来兴奋神经元, 例如通过G-蛋白诱导的[Ca2+]从肌浆网释放引起胞内[Ca2+]浓度增加[1]。硝苯地平阻断这一效应。我们知道硝苯地平为钙离子内流阻滞剂, 能阻滞心肌和血管平滑肌对钙离子的摄取, 扩张冠脉动脉、增加其血流量, 同时能扩张周围小动脉、降低外周血管阻力, 是用于预防和治疗冠心病、心绞痛、各种类型高血压的药物之一[2]。其作用机制为阻止钙内流, 阻碍细胞内钙的释放, 抑制磷酸二酯酶的活性, 与钙调节素相作用, 激活Na+、K+-ATP酶, 激活钙离子泵等。使外钙内流减少, 降低细胞内[Ca2+]浓度, 神经元的兴奋性降低。另外, 电压门控K+通道在调节神经元细胞动作电位的持续时间和兴奋性方面具有举足轻重的作用。虽然Ca2+通道拮抗剂硝苯地平对心脏K+电流具有抑制作用, 但硝苯地平对神经元K+电流的作用尚未被研究[3]。这可能是钙依赖性钾通道 (BKCa) , BKCa通道在中间神经元的突触传递及可塑性方面起重要的的作用[4]。这些中间神经元在运动的发生和活动协调方面发挥着作用。上述实验结果表明通过记录神经元的电生理特性来研究脊髓神经元的功能作用是一项重要的研究技术。

　　参考文献
　　[1]Miguel Fernández-Tenorio, Cristina Porras-González, Antonio Castellano, et al., Tonic arterial contraction mediated by L-type Ca 2+channels requires sustained Ca 2+influx, G protein-associated Ca 2+release, and Rho A/ROCK activation[J].European Journal of Pharmacology, 2012 (1-3) :88-90.
　　[2]Qiuxia Liao, Rui Zhang, Xiaoyu Wang, Weiwei Nian, Lulu Ke, Wei Ouyang, Zigui Zhang.Effect of fluoride exposure on m RNA expression of cav1.2 and calcium signal pathway apoptosis regulators in PC12 cells[J].Environmental Toxicology and Pharmacology, 2017 (54) :74-79.
　　[3]Xiao-Yue Qiu, Kai Li, Xiao-Qing Li, et al.The inhibitory effects of nifedipine on outward voltage-gated potassium currents in mouse neuroblastoma N2A cells[J].Pharmacological Reports, 2016 (3) :631-637.
　　[4]郭艳艳, 祁凤燕, 招明高.大电导钙依赖性钾通道参与调节杏仁核侧核突触传递[J].神经药理学报, 2012, 2 (1) :10-19.