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叶片是植物进行光合作用、蒸腾作用的重要器官。根据叶缘的锯齿程度, 可将叶片分为全缘叶、锯齿叶和缺刻叶[1,2]。植物的叶缘形态是植物长期进化的结果, 对其本身具有很重要的意义。研究表明, 缺刻叶的锯齿状物理形态更有利于散热, 防御高温灼伤, 从而提高植物的生存能力[3,4]。锯齿程度高的叶片, 液压效率高, 增强植物对干旱环境的适应能力[5]。缺刻叶在空间上具有更大的比叶面积, 相比全缘叶在竞争光资源上拥有更强的竞争力[6]。极度缺刻的叶片甚至可以接收到来自各方向的光照, 进一步提高了光合作用效率。晏艺真等[7]设计了基于叶缘特征的植物图像分类检索, 可见叶缘在植物分类学中也占有一定地位。
叶片是由茎尖分生组织两侧的多功能干细胞发育而来的[8]。在不同植物中, 叶片的形态是复杂多样的, 其形状、大小有着明显的不同。叶缘属于叶片的次级结构, 直接影响到叶片本身的形态[9,10]。叶缘的锯齿程度不仅体现了植物对环境的适应能力, 更影响到植物的观赏价值。不同锯齿程度的叶片可给人们带来不同的美学享受。对植物叶缘锯齿发育分子机制的研究有助于人们利用生物技术手段改良植物的叶缘性状。在叶片的生长过程中, 叶缘的锯齿程度受到多种叶缘发育因子的调控。笔者概述了参与叶缘锯齿发育各个因子的表达与功能, 旨在为进一步认识植物叶缘锯齿发育提供文献依据。
1、植物激素在叶缘锯齿发育中的功能
1.1、生长素
生长素是重要的植物激素之一, 调节植物生长发育的各方面, 如形态建成、器官发生、顶端优势、细胞分化等[11,12]。在叶缘锯齿发育过程中, 生长素起到了非常重要的作用。生长素通过在叶缘处分布的浓度梯度来决定叶片锯齿的发生位置[13,14]。生长素浓度峰值处的细胞生长快, 形成锯齿的尖端, 而生长素浓度最低处细胞生长缓慢, 形成锯齿的凹陷区[15]。生长素输入转运蛋白有AUXIN RESISTANT 1 (AUX1) 和LIKE AUXIN RESISTANT 1/2/3 (LAX1、LAX 2和LAX3) , 它们参与生长素由细胞外向细胞内运输的过程。其相关的拟南芥突变体会导致生长素转运紊乱, 进而对叶缘的形成产生影响。如拟南芥三突变体aux1/lax1/lax2和四突变体aux1/lax1/lax2/lax3会延迟叶缘锯齿的形成[16]。在Tang等[17]的研究中, 激酶PI4Kγ5 (atypical type II phosphatidylinositol 4-kinase) 参与调控拟南芥叶缘锯齿发育, 该激酶在叶片的整个发育时期均有表达, 其突变体pi4kγ5-1显示锯齿状叶片。PI4Kγ5可间接调控生长素的生物合成和细胞分裂, 从而影响到叶缘。
PIN1 (PIN-FORMED1) 是生长素极性运输蛋白, 属于PIN蛋白家族成员。PIN1蛋白极性定位于细胞膜上, 功能是将生长素从细胞内运输到细胞外[18,19]。在叶缘发育中, PIN1对形成和维持生长素浓度梯度起到重要作用[20,21]。野生型拟南芥叶片具有许多微小的锯齿, 但其pin1-7突变体的叶片锯齿则完全消失, 而在pin1-7中回复表达PIN1, 叶片又恢复了微小锯齿的表型[22]。分析认为, PIN1基因的突变会导致生长素在叶缘处的发布发生紊乱, 无法形成浓度梯度, 最终产生了圆滑的叶片。这暗示PIN1是通过调节生长素的浓度分布来间接控制叶缘的发育。总之, 生长素对植物叶缘锯齿的形成起到最直接的作用。
1.2、细胞分裂素
在高等植物中, 细胞分裂素的功能是调节细胞的分裂和分化, 广泛参与到植物的生长发育过程中[23]。细胞分裂素在叶缘发育过程中对维持分生组织的活性起到重要作用。IPT7 (ISOPENTENYL TRANSFERASE 7) 是细胞分裂素合成途径的关键基因。在番茄中, 表达AtIPT7会提高细胞分裂素的含量, 从而导致叶片变得更加复杂。但是, 异位表达降解细胞分裂素的关键基因CKX3 (CYTOKININ OXIDASE 3) , 则叶片锯齿消失[24,25]。可见细胞分裂素具有正向调控叶缘锯齿的功能。值得注意的是, Rupp等[26]很早就发现细胞分裂素具有促进STM (SHOOT MERISTEMLESS) 表达的功能, STM可促使叶缘复杂化。推测细胞分裂素可能通过调控STM达到控制叶缘的目的。
1.3、赤霉素
赤霉素对植物叶片的形态建成具有一定的作用[27,28]。通过外源表达赤霉素的合成基因GA20ox (GA20-oxidase) , 可使番茄叶片由复杂变得简单, 并减少叶锯齿的形成[29,30]。然而, 若过表达赤霉素的降解基因GA2ox (GA2-oxidase) , 则会促进叶片锯齿的形成[31]。可见赤霉素具有负调控叶锯齿形成的功能。在叶缘发育过程中, 生长素、细胞分裂素和赤霉素不仅可以相互独立起作用, 而且还可以通过激素与激素的相互拮抗或协同发挥作用。如细胞分裂素依赖于生长素在叶缘处的定位起作用。Shani等[25]的研究发现, 若生长素浓度梯度被破坏, 则细胞分裂素调控叶缘发育的能力将被大大削弱。这说明通过控制多种激素来调控叶缘的形态, 其效果往往好于单个激素。
2、CUC家族在叶缘锯齿发育中的功能
在拟南芥中, CUC基因家族由3个成员组成, 分别是CUC1、CUC2和CUC3[32]。这3个基因的功能具有部分的冗余性, 主要参与子叶的分离和组织器官边界的形成[33,34]。在Hasson等[35]的研究中, CUC2被鉴定在叶原基和锯齿凹陷区特异性表达, 对叶锯齿凹陷区深度的形成起到至关重要的作用。拟南芥单突变体cuc2-1和cuc2-3均形成全缘叶, 表现为叶锯齿完全消失。CUC1由于不在叶缘处表达, 因此不参与叶锯齿形成。CUC3也被发现对叶锯齿形成起到一定的作用。拟南芥cuc3-105的叶片锯齿程度介于野生型和cuc2-3之间。在调控叶锯齿形成过程中, CUC2不仅能单独起作用, 而且还能依赖于CUC3发挥作用。尽管CUC2和CUC3都能正向调控叶缘锯齿的形成, 但CUC3对锯齿的调控程度远不及CUC2。
3、MicroRNA在叶缘锯齿发育中的功能
3.1、MIR164
拟南芥中, MIR164可编码3个基因, 分别是MIR164A、MIR164B和MIR164C[36]。其中, MIR164A被认为在叶缘发育中抑制CUC2的表达, 从而减少叶锯齿的形成。MIR164B尚未发现在植物发育中的具体功能, 而MIR164C则在控制花瓣数目中起到一定作用[37,38,39]。在拟南芥中, 突变体mir164a-4叶片锯齿程度大大加深甚至形成了缺刻叶, 而过表达MIR164A可减少叶片锯齿的形成[2]。可见, MIR164A本身起到了负向调控叶缘锯齿大小的作用。在mir164a-4中, 若引入CUC2的突变, 则叶片由深裂变成全缘, 比野生型叶片锯齿程度更低。这暗示了MIR164A对叶锯齿的调控可能在CUC2的上游。在拟南芥突变体CUC2-1D中, 由于CUC2的剪切位点发生了变化, 导致MIR164A无法剪切CUC2的mRNA, 使叶片锯齿程度加深[40]。分析认为, MIR164A通过剪切CUC2的m RNA来抑制CUC2的表达, 进而减少锯齿的形成。MIR164A和CUC2在调控叶缘发育中均发挥着重要作用, 共同控制着叶缘的锯齿程度。
3.2、MIR156
在叶片发育早期, MIR156可负调控TCP (TEOSINTEBRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF) 基因家族的表达, 该家族中的TCP2、TCP3、TCP4、TCP10和TCP24具有抑制CUC2和CUC3的功能[41,42]。随着叶片的发育, MIR156会抑制SPL9 (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE 9) 的表达, 而SPL9本身可与TCP4形成蛋白复合体[43]。若MIR156升高, 则SPL9降低, 导致游离的TCP4蛋白增多, 最终使CUC2蛋白减少。可见, MIR156可通过调控TCP和SPL9间接抑制CUC2和CUC3的表达, 从而抑制叶缘锯齿的形成。
3.3、MIR319
MIR319又称作JAG (JAGGED) , 参与调控植物横向器官的形态建成[44]。在拟南芥突变体jag中, 花瓣变得窄而卷曲、雄蕊变短[45]。李婉莎等[46]早在2012年从拟南芥基因激活标签突变体库中分离到一个突变体pCB1294, 并且成功鉴定出该基因编码MIR319B。该突变体叶缘表现为极度的锯齿, 实时定量揭示突变体pCB1294中MIR319B的表达量是野生型的11倍之多。这说明MIR319可正向调控叶缘锯齿的形成。Rubio-Somoza等[47]构建了MIR319的过表达株系35S::MIR319A, 该拟南芥叶缘显示出强烈的锯齿结构, 甚至形成复叶。Koyama等[41]对MIR319进行了更深入地研究, 发现拟南芥单突变体mir319a和mir319b均显示出较低程度的叶缘锯齿, 且双突变体mir319a/b的叶缘锯齿结构完全消失, 形成全缘叶。实时定量显示在mir319a/b中, TCP基因家族表达量显着升高, 而CUC2和CUC3的表达量显着降低。可见, MIR319对叶缘锯齿的形成具有诸多方面的调控功能。值得注意的是, 双突变体cuc2 mir319a和cuc2 mir319b的叶片相比单突变体cuc2更圆滑, 这说明MIR319调控叶缘锯齿的发育可不依赖CUC2。
4、ERECTA和EPFL2在叶缘锯齿发育中的功能
ERECT是拟南芥中一个类受体激酶基因, 负责编码一段富含亮氨酸的重复序列[48]。ERECTA广泛参与植物的发育进程, 如控制叶、花、荚果的形态[49,50], 改变蒸腾效率[51], 参与激素、光等信号通路[52,53], 甚至还影响到植物的抗病性[54]。在拟南芥中, ERECT基因家族包括ER (ERECTA) 、ERL1 (ER-LIKE 1) 和ERL2, 它们均参与正向调控叶缘锯齿的形成。ERECT基因的缺失会导致叶缘锯齿程度降低[55,56]。在拟南芥茎尖分生组织中, ERECTA会影响到PIN1在叶原基的表达, 进而调控生长素的转运, 最后影响到叶缘锯齿的形成。
表皮模式因子EPFL (EPIDERMAL PATTERNING FACTOR-LIKE) 基因家族可编码一类分泌肽, 参与调控气孔、花絮等组织的形态发生[57,58]。Tameshige等[59]研究发现该基因家族的EPFL2可与ERECTA相互作用形成复合体对生长素产生抑制作用, 有利于叶缘凹陷区的形成。在拟南芥突变体epfl2或erecta及其双突变体中, 叶缘锯齿程度均显着降低[52]。这说明在叶缘锯齿发育中, ERECTA不仅能单独起作用, 还能和EPFL2共同促进叶缘锯齿的形成。
5、KNOX1
KNOX1 (ClassⅠKNOTTED-like homeobox) 基因家族在叶片的起始发育过程中参与重要作用, 其在叶原基的表达模式直接影响到叶片会发育成单叶还是复叶[[60,61]-61]。在拟南芥中, 过表达KNOX1会使叶片发育成缺刻叶[[63]]。在复叶植物番茄中, 上调KNOX1的表达会增加复叶的重复结构[[62]]。而在单叶植物中, KNOX1的表达会受到AS1 (ASYMMETRIC LEAVES 1) 和AS2的抑制[[63]]。拟南芥突变体as1-1和as2-1均会产生缺刻叶片[[64]]。值得注意的是, KNOX1的表达会受到生长素的抑制[[65]]。在拟南芥中, KNOX1基因家族包括STM、KNAT1 (KNOTTED-LIKE FROM ARABIDOPSIS THALIANA 1) 、KNAT2和KNAT6。Piazza等[[66]]研究揭示了STM的表达量与叶缘锯齿程度呈正相关。KNAT1又称为BP (BREVIPEDICELLUS) , 在顶端分生组织的维持中起到重要作用[[67]]。与野生型拟南芥相比, 35S::KNAT1的叶片表现为极度缺刻, 甚至形成复叶, 但在此基础上引入cuc2-3突变, 则锯齿程度降低[[35]]。实时定量结果显示, 在拟南芥突变体cuc2-1D中, BP的表达并没有改变[[41]]。由此推断KNAT1对叶缘发育的调控可能在CUC2的上游。总之, KNOX1基因家族的高表达会促使叶片复杂化, 表现为更强的叶缘锯齿或形成复叶结构。
6、其他叶缘锯齿发育因子的功能
6.1、DPA4
DPA4 (development-related Polycomb group targets in the apex 4) 可编码一个假定的RAV (Related to ABI3/VP1) 转录抑制因子, 并且在叶片锯齿的凹陷区表达, 这与CUC2的表达区域一致。Engelhorn等[68]研究发现, 拟南芥T-DNA插入突变体dpa4-2产生出较强的锯齿状叶片, 而过表达DPA4的拟南芥叶片非常圆滑。实时定量揭示了在dpa4-2中, CUC2的表达量增高, 而在35S::DPA4中CUC2的表达量降低。可见, DPA4具有抑制CUC2表达的功能, 可负向调控叶缘锯齿的形成。研究表明, DPA4的表达受PcG (Polycomb group) 蛋白家族严格控制, PcG可通过组蛋白甲基化修饰来抑制靶基因DPA4的表达。在PcG突变体中, DPA4的表达量提高6倍之多。PcG属于重要的表观遗传调控因子, 这暗示着某些表观遗传调控通路也参与到叶缘锯齿发育的进程中。
6.2、SERRATE
在拟南芥中, SE (SERRATE) 基因被认为编码一个锌指蛋白调节分生组织的活力, 参与幼苗和叶轴的生长发育[69,70]。在Prigge等[69]研究中, 突变体se子叶和胚胎的发育均产生缺陷, 并且莲座叶的数目也减少。对叶片的表型进行观察可以发现, 与野生型拟南芥相比, se的叶缘产生一定程度的锯齿。Northern杂交显示, se中多数MicroRNA被下调, 包括mi R164、mi R163、mi R156、mi R168、mi R171等[71]。由此可以推测SERRATE可能是通过调控mi R156和mi R164进而参与叶缘发育的调控。
叶缘是叶片重要的形态特征之一, 是植物长期进化的结果。叶缘锯齿程度的高低是由遗传因素和环境共同决定的。叶缘锯齿形成的分子机制是错综复杂的, 其中涉及到多个植物激素、基因、转录因子和MicroRNA。表1介绍了拟南芥中参与叶缘锯齿发育进程中相关基因的表达与功能, 为叶缘锯齿发育研究提供文献依据。
表1 拟南芥中参与叶缘锯齿发育相关基因的表达与功能
7、展望
叶缘锯齿发育涉及到多条信号途径, 是一个复杂的调控网络。纵观国内外的研究成果可以发现, 生长素、CUC2和MicroRNA一直是该领域研究的热点, 它们直接参与调控叶缘锯齿的形成。其他大部分的叶缘因子如MIR164A、EPFL2和DPA4等也需要依赖生长素和CUC2发挥调控功能。目前, 国内学者在该领域的研究主要集中在叶缘单突变体的分离与鉴定、单基因功能分析等较初级阶段。国外则已开展对叶缘双突变体、三突变体甚至是四突变体的深入分析, 对整个叶缘发育模型的研究也初具规模。笔者认为, 叶缘锯齿发育研究中已形成较明显的2个趋势, 一是进一步阐明关键因子生长素和CUC2的相互调控关系, 以及各个MicroRNA在叶缘锯齿发育中的详细功能;二是利用生物技术手段分离与鉴定出新的未知叶缘调控因子。
对叶缘锯齿发育的研究不仅具有重要的理论意义, 也具有潜在的应用价值。中国作为农业大国, 大部分蔬菜的经济价值源于叶片。已有研究报道, 叶缘的锯齿程度对植物的光合作用、呼吸作用以及胁迫应答起到重要的作用。如甘蓝的叶缘刻裂与其抗寒能力具有一定的相关性, 叶缘锯齿程度高的叶片在竞争光资源上具有优势。因此, 对叶缘锯齿发育不仅要关注理论上的研究, 更要侧重在农业生产中种质资源的开发与利用。叶缘形态也影响到植物本身的观赏价值。近年来, 国内观叶花卉发展迅猛, 与观花类的花卉相比, 观叶花卉具有观赏期长、易栽培等优点。观叶花卉凭借着奇特的叶型深受人们的喜爱。虽然利用分子手段改良花卉叶缘的案例未见报道, 但随着对叶缘锯齿研究的深入, 人为调控植物叶缘性状成为可能, 该研究将为园艺花卉的开发提供理论指导。
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