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Abstract：Polyamines are positively charged aliphatic compounds, which are involved in regulation of gene expression and cell signal transduction in human and mammalian by binding DNA, RNA and protein.Polyamines can affect the secretion of hypothalamus-pituitary-gonadal axis hormones, and then affect the quality of germ cells, luteal formation and embryonic development, and play a regulatory role in human and mammalian reproductive process, but the specific mechanisms of those effects have not been clarified.This paper focuses on the recent advances in biosynthesis, distribution and origin of polyamines, and the roles of polyamines on spermatogenesis, oogenesis, blastocyst implantation and development.The aim of this study is to provide evidences for the use of polyamines in assisted reproductive techniques (ART) to improve pregnancy outcomes.
Keyword：Polyamines; Biogenic polyamines; Reproductive techniques, assisted; Hypothalamo-hypophyseal system; Spermatozoa; Ovum; Embryonic development; Fertility;
多胺 (polyamines) 广泛分布于人及哺乳动物体内, 具有促进某些组织生长的作用, 对于维持细胞膜正常功能, 也起着重要作用。具有重要生理功能的多胺, 主要包括腐胺 (putrescine) 、亚精胺 (spermidine) 、精胺 (spermine) , 主要参与人及哺乳动物的健康维持、精子发生、卵子形成和胚胎发育等过程。1677年, Lewenhoeck[1]首先从精浆中分离出多胺。随着生殖医学的发展, 多胺在人及哺乳动物生命发展历程中的作用逐渐被认识。近年有关多胺用于辅助生殖技术 (assisted reproductive technology, ART) 中, 改善妊娠结局的作用备受关注。但是, 对于多胺在精子发生、卵子形成及受精卵发育等过程中的调控作用机制, 迄今尚未阐明[2]。笔者拟就多胺的组成、功能, 以及在人及哺乳动物胚胎形成与发育等方面所起作用的最新研究进展进行阐述, 旨在为多胺应用于ART中改善妊娠结局提供依据。
1、多胺的生物合成
多胺是指分子中含有2个以上氨基的脂肪族化合物, 其主要合成原料为鸟氨酸和甲硫氨酸, 关键酶是鸟氨酸脱羧酶 (ornithine decarboxylase, ODC) 。精氨酸、赖氨酸和蛋氨酸是多胺合成的主要前体。多胺的生物合成包括经典合成途径和非经合成途径。其中, 经典合成途径是指鸟氨酸在ODC催化作用下, 脱羧基后, 经相应转化而生成腐胺;非经典合成途径是指以精氨酸为原料, 在精氨酸脱羧酶 (arginine decarboxylase, ADC) 催化作用下合成胍丁胺, 胍丁胺在胍丁胺水解酶催化作用下生成腐胺。腐胺与甲硫氨酸脱羧基形成的氨丙基结合, 经亚精胺合成酶催化生成亚精胺, 亚精胺再在精胺合成酶作用下生成精胺。同时, 精胺在精胺氧化酶 (spermine oxidase, Smox) 作用下, 可不经脱羧基过程而直接转化为亚精胺。亚精胺在亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶 (N1-acetyltransferase, SAT1) 作用下, 形成N1-乙酰亚精胺, 再在多胺氧化酶作用下转化为腐胺[2]。
2、多胺的体内分布
多胺通过结合DNA、RNA和蛋白质等大分子, 参与人及哺乳动物的基因表达调控、蛋白质翻译、细胞信号传导、细胞增殖和凋亡等过程[3], 因此细胞内多胺稳定是维持细胞正常生命活动的前提。自多胺在人类精浆中被发现后, 在人体多种组织中已检测到多胺的存在。Gamat等[4]在体外培养的前列腺组织细胞中加入ODC抑制剂二氟甲基鸟氨酸 (difluoromethylornithine, DFMO) 后, 再将前列腺组织细胞注入小鼠体内, 发现小鼠前列腺分泌功能受到明显抑制。Fenelon等[5]在体外培养的水貂胚胎中添加腐胺, 发现培养液中催乳素含量升高, 由此证实哺乳动物催乳素的分泌与多胺表达有关。此外, 在人类胃肠道、尿液、神经胶质细胞等, 均检测到多胺的存在[6,7]。
3、多胺来源
人及哺乳动物体内的多胺, 主要来源于内源性生物合成、肠道微生物分解和饮食直接摄取3种途径。多胺与人体健康密切相关, 饮食中多胺的摄取远高于内源性生物合成, 因此食物是多胺的重要来源[8]。Ali等[9]采用高效液相色谱法检测人类日常饮食中多胺含量的结果显示, 新鲜葡萄柚汁、豆制品及动物肝脏中多胺含量较高, 欧洲国家等已将多胺列为人体必需营养物质之一。因此, 日常饮食中适当摄取富含多胺的食物, 有益于人体健康。
4、多胺对人及哺乳动物生殖的调控作用
4.1、多胺与雄性精子发生的关系
雄性睾丸组织中多胺含量高于人体内其他组织, 这表示多胺在雄性精子发生和受精过程中发挥着作用[10]。多胺对精子发生的可能作用机制包括以下3种。 (1) 通过影响雄性性激素合成, 干扰精子发生。Rasila等[11]在睾丸组织中发现抗酶抑制剂 (antizyme inhibitors, AZIN) 基因高表达, 它可增强ODC活性, 使睾丸组织的多胺含量增加, 促进精子发育, 由此证实多胺与精子发育存在联系。 (2) 初级精母细胞第一次减数分裂的正常发生需要多胺参与。Pegg[12]研究结果发现, 精胺合成基因被敲除小鼠的生育力丧失。解剖该类小鼠睾丸时, 仅发现精原细胞或初级精母细胞, 未见精子形成, 这是典型的成熟障碍型无精小鼠动物模型。 (3) 多胺可增强精子活动力、能量代谢及精子顶体反应[13]。Bauer等[14]以酵母菌模拟哺乳动物受精过程的研究结果发现, 亚精胺缺乏的雄性酵母菌原生质突起, 不能结合雌性酵母菌原生质突起, 这也证实亚精胺与精子正常受精密切相关。尽管多胺对精子正常发育是必需的, 但是多胺含量过高, 同样可引起精子发育异常。因此, 适宜浓度多胺是保证精子正常发育的前提。
4.2、多胺与雌性卵巢功能的关系
4.2.1、多胺与卵子发育
最新研究结果显示, 多胺是雌性生育力的营养调节剂, 可促进卵子发育[2]。ODC主要在卵巢卵泡膜细胞和颗粒细胞表达, 这些部位同时高表达促黄体激素 (luteinizing hormone, LH) 和绒毛膜促性腺激素 (chorionic gonadotropin, hCG) 受体。Tao与Liu[15]随机对照实验结果发现, LH可刺激腐胺含量短暂升高, 伴随着卵母细胞的排出, 抑制腐胺升高, 不影响卵母细胞的成熟及排卵, 但是异常卵母细胞数却明显增加, 究其原因与腐胺缺乏导致卵母细胞染色体异常分离有关。Jin等[16]通过于体外培养猪卵母细胞中添加精胺后的研究发现, 精胺可使卵母细胞活性氧含量降低, 谷胱甘肽含量升高, 由此证实精胺可增强卵母细胞抗氧化功能, 维持同源染色体的正常分离。Bastida等[17]以未成熟雌鼠为实验对象, 采用DFMO抑制ODC合成后, 发现雌鼠的卵巢生长、卵泡形成及小鼠动情周期的启动均发生异常。Tao等[13]在雌性小鼠饮用水中添加腐胺的研究结果发现, 雌性小鼠子宫囊胚着床率明显提高, 这再次证实排卵期多胺含量的变化, 对于卵子正常发育具有重要作用。此外, 多胺与一些固醇类激素在刺激卵泡发育方面, 可能存在协同作用, 然而其具体作用机制, 迄今尚不明确[18]。
4.2.2、多胺与黄体功能
采用原位免疫杂交法对卵巢癌女性的卵巢组织进行多胺合成相关蛋白检测的结果发现, 卵巢组织AZIN含量增高[18]。对于哺乳类雌性动物模型的研究结果发现, 随着LH峰的到来, 卵巢组织的ODC表达量增加[15]。然而, Kang等[19]动物实验结果发现, 敲除雌性白鹅卵巢颗粒细胞ODC抗酶基因, 即抗酶 (antizyme) , 使颗粒细胞LH受体基因表达水平降低后, 可影响下丘脑-垂体-性腺轴激素的分泌。尽管该实验结果与Makitie等[18]研究结论相反, 但是也可间接证明ODC与黄体形成及其激素分泌存在一定联系[19]。Mkitie等[18]采用免疫组织化学法在人体膜黄体细胞中发现, 抗酶可与ODC结合形成异源二聚体, 从而抑制ODC活性, 降低黄体组织多胺含量, 阻止多胺含量过高触发黄体细胞凋亡, 同时抗酶还可参与卵巢生发上皮细胞增殖调控, 促进黄体形成。尽管目前尚无证据表明ODC可调节性腺轴激素分泌, 但是多胺在调节卵巢黄体形成及激素分泌中的作用, 却不可否认。由此可见, 雌性哺乳动物卵巢性激素合成受到多胺调控, 从而影响黄体发育[11,18]。然而, 有关多胺影响黄体形成的具体作用机制, 仍有待进一步研究、证实。
4.3、多胺与胚胎功能的关系
4.3.1、胚胎早期发育
自从在小鼠胚胎中发现ODC后, 多胺与胚胎早期发育的关系, 受到生殖医学相关领域的关注。Mandal等[20]将携带多胺分解酶基因的腺病毒转录至人胚肾T淋巴细胞, 导致细胞内亚精胺和精胺迅速耗竭后, 采用透射电镜观察T淋巴细胞的结果显示, 细胞萎缩、细胞核碎裂、线粒体空泡化和线粒体内膜自然反卷成小的膜泡等凋亡形态学变化, 由此提出T淋巴细胞凋亡主要是由细胞内亚精胺和精胺耗竭所致的假说。Cui与Kim[21]研究结果也证实这一假设。其研究结果显示, 实验组猪受精卵 (猪受精卵体外培养液中添加多胺) 囊胚形成率较对照组 (猪受精卵体外培养液中未添加多胺) 明显增高, 并且差异有统计学意义 (P<0.05) 。采用PCR法检测这些胚胎中基因表达的结果显示, 介导细胞凋亡的Bak/Bcl-XL、Fas/Bcl-XL、Caspase 3基因的mRNA表达量降低。同时, 在猪受精卵体外培养液中添加DFMO的结果显示, 上述凋亡基因表达上调, 从而提出多胺可通过抑制早期胚胎凋亡, 提高囊胚形成率的假说[21]。多胺影响胚胎基因表达异常, 影响胚胎发育的原因, 与多胺参与染色质、细胞骨架结构稳定及蛋白质合成, 从而保护细胞免受氧化应激损伤等密不可分[22]。因此, 对于人及哺乳动物体内多胺与胚胎功能的关系, 应进一步进行多胺调控胚胎发育的分子机制研究。
4.3.2、人及哺乳动物胚胎着床
胚胎着床是囊胚与子宫相互作用的过程, 其成功与否主要取决于囊胚和子宫之间的相互识别。虽然很多因素已被证实可影响胚胎着床, 然而其影响胚胎着床的分子机制, 迄今仍不清楚[23]。Fenelon与Murphy[24]采用DFMO抑制妊娠小鼠ODC活性的研究结果显示, 小鼠胚胎不能进行正常着床, 从而提出胚胎发育异常可能与子宫腔多胺含量有关。然而, 也有研究结果显示, 抑制妊娠小鼠ODC活性后, 胚胎着床并未受影响, 究其原因可能与多胺合成是相关基因协同表达调节的缘故[25]。Lenis等[26]对绵羊胚胎的体内试验结果显示, 胚胎着床期子宫腔内鸟氨酸含量较正常, 动情周期明显增高, 敲除绵羊胚胎ODC基因后, 胚胎着床率下降。这验证了在绵羊妊娠期子宫腔多胺含量适当升高, 对绵羊胚胎成功着床至关重要。由此可见, 多胺对哺乳动物胚胎着床具有重要作用。
4.4、多胺代谢异常与生育力的关系
人及哺乳动物体内多胺合成均受到ODC的严格调控, 若多胺含量异常, 则通过以下2种途径调节细胞内多胺池的稳定。 (1) 抗酶通过抑制ODC活性, 降低细胞内多胺含量[22]; (2) 上调多胺转运蛋白表达, 调节细胞内多胺含量。Abdulhussein与Wallace[27]研究结果发现, 哺乳动物细胞膜多胺转运载体, 即溶质载体 (solute-linked carrier, SLC) 转运体家族, 在哺乳动物细胞膜广泛存在, 可调节细胞内多胺含量, 体内代谢产生的多胺大部分经过SLC转运。调节多胺代谢的酶和多胺转运蛋白异常, 均可引起哺乳动物体内多胺含量改变, 从而引起哺乳动物生育力异常。若男性精液多胺含量较正常值显着降低, 则可导致少、弱精症[13];而女性体内多胺含量较正常值显着降低, 则可导致LH峰值较正常值显着降低, 引起不同发育阶段生殖细胞异常[15,16]。
5、多胺应用的展望
自从在人及哺乳动物精浆中发现多胺这种“三面晶体”后, 有关多胺的合成、生理功能、体内分布及其在人类生育过程中的作用, 越来越受到生殖医学相关领域的重视。多胺的生理功能, 使其在人及哺乳动物生殖细胞成熟、胚胎着床及发育等生命过程中发挥非常重要作用。在排卵过程中, 体内短暂升高的腐胺, 可经肾脏从尿液中快速排出, 因此排卵过程中体内腐胺短暂升高是安全的。这可以为在啮齿类动物受精卵的体外培养基中添加腐胺, 以提高囊胚形成率提供证据。无论是进行体外受精-胚胎移植, 或是准备自然受孕者, 在排卵前期适当补充多胺, 是一种理想的改善妊娠结局的方法[13,16]。但是, 目前以人体为试验对象应用多胺改善妊娠结局的研究, 尚未见文献报道[13]。哺乳动物受精卵体外培养液中添加多胺改善妊娠结局的试验, 为提高ART成功率提供了有力的证据。对于生殖过程中多胺的作用机制迄今尚未明确, 因此多胺应用于人类不孕不育治疗的有效性和安全性尚不明确[2]。如何将多胺对生殖调控的研究从哺乳动物实验转化到临床, 应用于ART对人类不孕不育的治疗, 仍需进一步探索、证实。
参考文献
[1] Lewenhoeck DA.Observationes D.Anthonii Lewenhoeck, de natis′e semine genitali animalculis[J].Phil Trans, 1677, 12 (142) :1040-1046.
[2] Lefèvre PL, Palin MF, Murphy BD.Polyamines on the reproductive landscape[J].Endocr Rev, 2011, 32 (5) :694-712.
[3] Publio BC, Moura TA, Lima CHM, et al.Biophysical characterization of the DNA interaction with the biogenic polyamine putrescine:a single molecule study[J].Int J Biol Macromol, 2018, 112:175-178.
[4] Gamat M, Malinowski RL, Parkhurst LJ, et al.Ornithine decarboxylase activity is required for prostatic budding in the developing mouse prostate[J]. PLoS One, 2015, 10 (10) :e0139522.