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随着抗生素在畜牧养殖业中的不合理应用, 耐药菌株层出不穷, 尤其产超广谱β-内酰胺酶耐药菌株的出现, 给畜牧养殖业造成了极大的经济损失[1,2]。在动物养殖业中, 危害较大的致病菌有大肠杆菌、沙门氏杆菌、绿脓杆菌等, 而大肠杆菌又是极易产生耐药性的细菌之一, 如何解决养殖动物大肠杆菌耐药问题已经成为目前研究的热点[3]。因此, 研发具有天然、高效、绿色、不良作用低的药物既可防治细菌性疾病, 又符合当代绿色养殖的目标[4]。大量的研究结果表明, 某些中草药和抗生素联用不仅能够提高药物的抑菌作用, 而且也能够抑制部分耐药菌株的出现[5]。中草药是中国特有的、丰富的药材资源, 有“天然抗生素”的美称, 其具有来源广泛、品种繁多、价格低廉、成分复杂、不良作用小、不易使细菌产生耐药性、易于代谢等优点, 受到了养殖工作者的信赖和喜爱[6]。基于此, 笔者选择从河北省昌黎县某养殖场分离的狐狸源大肠杆菌作为试验菌株, 考察2种抗生素和4种中草药的体外抑菌活性, 以期为日常动物养殖合理用药提供参考。
1、材料
1.1、试验药物
苏木、诃子、五味子、秦皮, 均购自秦皇岛民乐医药连锁有限责任公司;庆大霉素、头孢曲松粉末, 河北省预防兽医学重点实验室保存。
1.2、试验菌株
致病性大肠杆菌, 分离自秦皇岛昌黎县某养殖厂患病死亡的狐狸肝脏, 河北省预防兽医学重点实验室保存。
1.3、主要仪器与试剂
冰箱 (型号为BCD-649WDCE) , 购自青岛海尔股份有限公司;隔水式恒温培养箱 (型号为GHP-9080) , 购自上海一恒科学仪器有限公司;全自动高压灭菌锅 (型号为G154DWS) , 购自致微 (厦门) 仪器有限公司;超净工作台 (型号为YT-CJ-1D) , 购自北京亚泰隆仪器技术有限公司;96孔细菌培养板, 购自杭州微生物试剂有限公司;营养琼脂 (NA) 、营养肉汤 (NB) , 均购自青岛高科园海博生物技术有限公司。
2、方法
2.1、中草药药液的制备
采用水煎法提取中草药苏木、诃子、五味子、秦皮的有效成分。首先称取这4种中草药各50 g, 加入纯化水500 mL, 浸泡1 h;煎煮30 min后改用文火煮1 h, 纱布过虑;得到的药渣加入300 mL水继续煎煮30 min, 过滤;合并2次得到的滤液, 加热浓缩至50 mL, 最终得到的药液浓度为1 g/mL, 经过高压灭菌、分装后4 ℃保存, 备用。
2.2、头孢曲松、庆大霉素药液的制备
精密称量头孢曲松、庆大霉素于容量瓶中, 加入灭菌的磷酸盐缓冲溶液 (PBS) , 制成终浓度为1 280 μg/mL的药液, 用孔径为0.22 μm的滤器过滤该药液, 得到的药液4 ℃保存, 备用。
2.3、菌液的制备
用灭菌的接种环蘸取狐狸源致病性大肠杆菌菌液, 无菌涂布于伊红美蓝培养基上, 置于37 ℃隔水式恒温培养箱中培养12 h后无菌挑取单个菌落于6 mL营养肉汤液体培养基中培养12 h。采用平板法计数, 最终将菌液浓度稀释至1×107 cfu/mL。
2.4、最小抑菌浓度 (MIC) 的测定
运用微量肉汤二倍稀释法测定4种中草药和2种抗生素的MIC值。取无菌96孔细菌培养板, 将第1孔至第12孔分别加入营养肉汤200 μL;在第1孔中加入药液200 μL, 混匀, 吸取200 μL至第3孔中, 再次混匀, 直至第11孔, 混匀后吸取200 μL液体弃去;接着每孔加入菌液 (菌液浓度为1×107 cfu/mL) 10 μL。每种药物做3个重复, 以第12孔为对照, 将培养基置于隔水式恒温培养箱中培养24 h[7]。结果判定:肉眼观察, 未见细菌生长时药物的最小浓度即为MIC。
2.5、最小杀菌浓度 (MBC) 的测定
从各个药物的MIC和所有大于MIC浓度的微孔中各吸取菌液100 μL到NA培养基上点板, 37 ℃培养12 h, 观察有无菌落生长, 无菌落生长的相应微孔中的最低药物浓度即为该药物对狐狸源大肠杆菌的MBC[8]。
2.6、中草药与抗生素联用的联合抑菌浓度 (FIC) 指数的测定
采用微量肉汤棋盘稀释法测定4种中草药和2种抗生素联用的MIC值。具体操作步骤如下:取出96孔细菌培养板, 以狐狸源大肠杆菌临床分离株作为试验菌株。根据单药的MIC值, 以2 MICA (A药MIC的2倍) 为最高浓度, 吸取100 μL沿着96孔板横轴依次倍比稀释至1/16 MICA (A药MIC的1/16) , 以2 MICB (B药MIC的2倍) 为最高浓度沿着96孔板纵轴同样倍比稀释, 直到1/16 MICB (B药MIC的1/16) 后每孔加入菌液 (菌液浓度为1×107 cfu/mL) 10 μL, 置于微量振荡器上震荡2 min, 然后将培养基置于37 ℃隔水式恒温培养箱中培养12 h, 测定2种药物联用时的MIC[9]。FIC指数= (A药联用时的MIC/A药单用时的MIC) + (B药联用时的MIC/B药单用时的MIC) 。
联合用药结果的判定:当FIC指数≤0.5时为协同作用, 当0.5<FIC指数≤1.0时为相加作用, 当1.0<FIC指数≤2.0时为无关作用, 当FIC指数>2.0时为颉颃作用[10]。
3、结果与分析
3.1、6种药物对狐狸源大肠杆菌MIC和MBC的检测
结果见表1。
表1 6种药物对狐狸源大肠杆菌MIC和MBC的检测结果mg·mL-1 导出到EXCEL
由表1可知:在4种中草药中, 五味子的MIC和MBC最小, 抑菌作用较好;苏木和诃子的MIC相等, 这两种药物的抑菌作用相当, 但MBC不同, 分别为125 mg/mL、62.5 mg/mL;秦皮对该菌的MIC相对较大, 抑菌作用较弱。说明中草药对该菌有抑制作用, 但抑菌作用不同。头孢曲松的MIC和MBC均比庆大霉素小, 说明头孢曲松对该菌的抑菌效果较好。
3.2、中草药与抗生素联用对狐狸源大肠杆菌FIC指数的检测
结果见表2。
表2 中草药与抗生素联用对狐狸源大肠杆菌FIC指数的检测结果
由表2可知:所选的6种药物共组成8个药物组合, 其中庆大霉素和苏木组合在抑菌方面表现为相加作用, 说明这两种药物联用可以增加体外抑菌效果;头孢曲松和苏木组合在抑菌方面表现为协同作用, 说明这两种药物联用可以使体外抑菌作用增强;庆大霉素和秦皮组合在抑菌方面表现为无关作用, 说明这两种药物联用时不能增强体外抑菌效果;其他组合则均为颉颃作用, 说明其他组合药物联用后体外抑菌效果明显减弱。因此, 在日常用药时一定要注意药物的合理搭配, 这样才能使中草药与抗生素联用取得预期的效果。
4、讨论
试验选用庆大霉素、头孢曲松、诃子、苏木、五味子、秦皮6种药物, 分别测定对狐狸源大肠杆菌的MIC和MBC, 并进一步测定了中草药与抗生素分别联用的FIC指数。结果表明, 这些药物单独使用时对狐狸源大肠杆菌均表现不同程度的抑菌作用, 其中头孢曲松抑菌活性最好。2种抗生素的MIC和MBC远小于4种中草药的MIC和MBC, 充分证实了抗生素疗法是治疗细菌病的首选药物。
中草药与抗生素联用以直接增效、降低或者缓解抗生素毒性及作用互补的方式发挥抑菌、杀菌作用[11]。庆大霉素、头孢曲松是秦皇岛地区常用的抗生素, 在日常中被用于细菌性疾病的防治。影响中草药与抗生素联用效果的因素有很多, 例如药物的酸碱性、理化性质、用药方式等, 导致中草药与抗生素联用体外抑菌效果降低的原因复杂[12], 可能是药物间发生物理或者化学变化导致抗菌作用降低, 也可能是药物pH值的变化使得药物溶解度降低。体外抑菌试验只是从基础研究的方向进行操作, 还应深入研究药物的具体化学成分、药理作用及药物在体内代谢的相互影响等, 这样才能组成合理的复方应用于日常养殖生产实践中[13]。
本试验采用微量肉汤棋盘稀释法测定中草药与抗生素联用对狐狸源大肠杆菌的体外抑菌作用。中草药成分复杂, 药物疗效往往受到多种成分的影响[14];在试验过程中对中草药采用不同提取工艺提取的有效成分常不尽相同, 且在实际操作中无法做到精确的量化, 因此本试验结果只能作为参考, 在体外抑菌方面显示无关作用的中草药与抗生素组合, 在日常实践是否配伍使用, 有待于深入的研究。
当前, 在日常养殖业中, 中草药与抗生素联用的情况逐渐增多[15], 在防治畜禽疾病方面疗效显着, 同时在经济动物养殖方面也具有良好的发展前景, 且已经生产出中西结合的成品药, 日常养殖效果良好, 受到广大养殖户的信赖[16]。“强效毒菌净”“增效泻痢宁”等都是应用中草药和抗生素按照一定的比例配制而成的[17];同时中草药与抗生素的复方饲料添加剂应用于养殖业的情况呈增多趋势, 如湖南地区研制的“促茸生长素”和四川某部门研发的“鸡用复方添加剂”等[17]。为了使中草药与抗生素联用更好地服务于生产实践, 联用时一定要注意配伍禁忌。中草药与抗生素联用有利有弊, 兽医医疗行业的工作人员应充分运用科学知识了解抗生素和中草药的药理作用和药物之间的互作机制, 提高药物疗效, 降低药物的不良反应[15,16]。
参考文献
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