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Abstract：The factors affecting the number of live bacteria were obtained by analyzing the counting methods of microecological agents in recent years, which provided the theoretical basis for the fermentation process of microecological agents in the future.By analyzing the influence of different conditions and fermentation technology on the number of living bacteria, the main factors which can affect the number of living bacteria were obtained.Results showed that fermentation temperature, fermentation time and culture medium were the main factors affecting the number of live bacteria.The fermentation temperature and fermentation time were controlled in the process of optimization of microecological preparation process.
Keyword：viable count; microecologics; preparation process;
微生态制剂源自于微生态学原理学, 其具有保护或调节微生态平衡的功能, 通过对宿主产生益生菌或者通过促进有益物质生成而制备成的制剂, 主要起到预防、调节和治疗疾病的作用。平板菌落计数法是将待测样品经过适当稀释, 将稀释后的样品在一定条件下进行培养, 培养后得到的样品中所含菌落的数量, 在一般情况下认为将一个肉眼直观可以看见的菌落代表一个单细胞。选择一个合适的稀释度并乘以相应的稀释倍数就可以比较准确地获得样品中微生物的具体数量。平板菌落计数法以其具有良好的重复性, 并可以相对准确地体现样品中活菌数量的优点, 成为了如今我国卫生标准规定所认定可行的方法, 并且在食品药品研究领域得到了广泛的应用。
1、微生物活菌计数方法分析
1.1、比浊法
在进行微生物液体培养时, 活菌的增加导致培养液浑浊度的增加, 该方法能够简单、快速、直观地观察活菌的生长趋势并且可以运用分光光度计测定其含量, 但在测定时未能判断微生物的死活, 所以该测定方法不太准确。
1.2、含氮量测定法
大多数微生物的含氮量比例较一致, 根据含氮量再乘以一定的数值即可测得其粗蛋白的含量, 从而大致可以得到活菌的生长情况, 传统方法常用凯氏定氮法进行测定, 该方法具有广泛的适应性、操作简单易行、试剂消耗少等优点, 但是其只能测得有机氮的含量, 所以其测定结果不太准确。
1.3、血球计数板法
此法是在显微镜下直接进行测定, 方便快捷并且仪器损耗较小, 但在一定的容积中微生物的个体数目包括死活细胞均被计算在内, 还有微小杂物也被计算在内, 这样得出结果往往偏高, 因此适用于对形态个体较大的菌体计数。
1.4、液体稀释法
对活菌进行连续的10倍系列稀释, 经过培养后, 记录每个稀释度出现生长的试管数, 然后查MPN表 (最大可能数表) , 再根据样品的稀释倍数就可计算其中的活菌含量, 该方法可较准确计算活菌数, 但操作过程比较繁琐。
1.5、平板菌落计数法
取一定体积的稀释菌液涂布在合适的固体培养基, 经培养后由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落, 即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞;统计菌落数, 根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数, 但其操作繁琐, 需要培养一定时间才能获得, 而且测定结果受多种试验因素 (如培养温度、培养时间、培养基等) 的影响, 但是该方法能够相对准确地获得活菌数量的信息, 所以被广泛应用。
2、影响微生物活菌数的因素
2.1、培养基对活菌的影响
不同培养基中所含的成分与含量都不尽相同, 例如最简单的基础培养基, 其主要成分就是牛肉浸液和蛋白胨, 其主要功能是用于细菌的增菌、检验;再在此基础上会有营养培养基, 可加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分, 供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长, 所添加的成分不同, 对活菌的影响就会不同;除此之外, 鉴别培养基在培养基中加入抑制剂, 去抑制标本中的杂菌生长, 有助于对所选择的细菌种类的生长, 主要用于区分目标菌, 不同培养基的用途不同, 其中不论是碳源或是氮源的含量均会对活菌数形成产生影响。
严佩峰等人[1]研究脱脂乳、脱脂乳酶解液和MRS 3种基础培养基对乳酸菌进行发酵培养, 得到脱脂乳酶解液是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合菌种较好的基础培养基, 保加利亚乳杆菌在该培养基进行培养时活菌数最高。张红艳等人[2]研究发现对碳源和氮源是影响地衣芽孢杆菌活菌数的主要因素, 其中玉米粉对地衣芽孢杆菌的活菌数影响最大。
2.2、培养时间对活菌的影响
根据活菌生长繁殖速率的不同, 可将生长曲线大致分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期, 所以活菌在不同时间之下进行培养都会对活菌的数量造成影响, 其中, 细菌在对数期生长迅速, 活菌数以恒定的几何级数增长, 生长曲线图上细菌数的对数呈直线上升, 达到顶峰状态, 期间细菌的形态、染色性、生物活性等都较典型, 对外界环境因素的作用敏感, 所以常会选取对数期的活菌作为研究对象进行试验。
高业成[3]将嗜酸乳杆菌采用倾注的接种方式于36℃分别在24, 48, 72 h进行培养, 结果得到嗜酸乳杆菌在培养到72 h时, 可以更加容易观察菌斑, 所以嗜酸乳杆菌的最佳观测期为72 h。闫亚梅[4]研究发现在选用保加利亚乳杆菌进行验证时, 当将其培养至48 h时, 活菌数最高且容易观察。
2.3、培养温度对活菌的影响
温度是通过影响微生物膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成与活性, 以及RNA的结构和转录等影响微生物的生命活动, 具体表现在2个方面:一方面, 随着微生物所处环境温度升高, 微生物细胞中的蛋白质和酶活性增强, 生物化学反应加快, 生长速率提高;另一方面, 随温度上升, 微生物细胞中对温度较敏感的组成成分 (如蛋白质、核酸等) 会受到不可逆的破坏。超过最适温度以后, 生长速率随温度升高而迅速下降。
易文芝[5]对益生菌发酵技术进行研究, 发现菌株在37℃进行培养时, 可以得到较高活菌数。张岩等人[6]研究发现乳酸乳杆菌在4℃的条件下进行保存可以得到最佳活菌数, 对延长乳酸乳杆菌活力提供了有力的支持。李志成等人[7]研究发现不同发酵温度下所制得的冻干发酵剂活菌数均有很大不同, 其中于30℃条件下进行发酵所制得的冻干发酵剂的活菌数最高。
2.4、接种方式对活菌的影响
常见的微生物接种方法有平板涂布法与液体倾倒法, 平板涂布法不仅可以用于计算活菌数, 还可以利用其在平板表面生长形成菌苔的特点用于检测化学因素对微生物的抑杀效应, 其可以计数, 可以观察菌落特征, 还可以进行菌种的分离, 但接种前需梯度稀释, 吸收量较少, 较麻烦, 平板不干燥效果不好, 容易蔓延;液体倾倒法相较平板涂布法简单, 将液体迅速直接倾注于平皿, 防止污染即可。
曾理等人[8]研究发现在采用平板涂布法测定乳酸菌活菌数时, 该法操作较为简便, 且经培养后发现乳酸菌的生长状况良好, 同时能够更加容易观察到乳酸菌的菌斑状态, 对乳酸菌的活菌计数非常适合。高业成[3]通过对嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别进行平板涂布法和液体倾倒法进行培养, 结果显示以上2种方法对活菌数的影响并没有显着差异。
2.5、微生物发酵工艺优化对活菌的影响
不同发酵工艺会对活菌的活力产生影响, 在不同发酵条件下所得到的活菌存活率均有所不同, 如果想要得到最高活菌数, 必须控制其发酵条件, 其中对发酵温度与发酵时间的控制尤为重要。
陈庆彩等人[9]研究发现以鼠李糖乳杆菌和瑞士乳杆菌二者进行共培养和发酵, 在初始酸碱度值6.8, 接种量6%, 发酵温度37℃, 鼠李糖乳杆菌与瑞士乳杆菌的接种比例2∶1, 除此之外, 瑞士乳杆菌提前接种3 h, 在这个条件下, 得到乳酸菌的活菌数最高。吴楠等人[10]研究发现影响德氏乳杆菌活菌数的主要因素是发酵温度、发酵时间与接种量, 其中发酵时间为最重要的影响因素。
2.6、其他因素对活菌的影响
除了以上所论述的一些常规影响条件外, 还有其他因素, 如水分含量、其他添加物质等会对活菌数产生影响。
刘秀清等人[11]研究发现不同益生元对鼠李糖乳杆菌的生长发酵产生影响, 其中低聚异麦芽糖对鼠李糖乳杆菌的生长促进作用效果最佳。郭羽等人[12]研究发现黄芪多糖对鼠李糖乳杆菌的生长具有促进的作用, 除此之外, 还可以改善鼠李糖乳杆菌的稳定性。鲍志宁等人[13]研究水分对干酪乳杆菌的影响, 发现在添加了保护剂聚葡萄糖的时候会使活菌变得更加稳定, 对活菌数的影响不大。杨郁等人[14]研究发现, 低聚糖对植物乳杆菌的影响较大, 相较葡萄糖而言, 可以运用低聚糖对其进行发酵。
3、结语
活菌数作为一种能够考查微生态制剂安全性的质量控制指标, 提高微生态制剂的活菌数能够极大地保持制剂的稳定性, 发酵温度与发酵时间作为影响活菌数的重要因素, 通过试验优化得到其最适发酵温度与发酵时间, 对活菌数的提高有益处。另一方面, 平板活菌计数法也可应用于检测微生态制剂类的活菌数量, 活菌数作为能够指示微生态制剂品质好坏与保存时间长短的最直观指标, 一直以来都是研究的热点。
参考文献
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