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摘要：我国海域面积辽阔,为保护海洋环境,维持海洋经济可持续发展,必须提高海洋环境监测能力。迅速发展的分子生物学技术作为一种有力手段能运用于海洋环境监测。论文概述了多种分子生物学技术方法(PCR、克隆文库、变形梯度凝胶电泳、环介导等温扩增、实时定量PCR、限制性片段长度多态性、核酸探针和基因芯片等)在鉴定海洋生物、评价海洋微生物安全、发现生物入侵种和评估海洋污染物的生态效应等方面的运用。期望为全面了解分子生物学技术并为海洋环境监测的合理应用提供理论借鉴。
关键词：分子生物学技术; 海洋环境; 环境监测; 基因;
1 前言
我国是一个海洋大国,有着1.8万多公里的大陆海岸线和1.4万多公里的岛屿岸线,拥有6500多个岛屿和约300万平方公里的管辖海域面积。海洋面积大约占到我国陆地国土面积的1/3。海洋是新的生存和发展空间,是生物资源、能源、水资源、金属资源的战略性开发基地,对世界经济的贡献率已经达到4%以上[1]。然而,随着沿海地区人口的增多、海洋经济的迅速发展和海洋开发利用程度的加强,导致大量工农业废水、养殖废水和生活污水排入海洋使得海洋近岸富营养化程度和有毒有害物质污染日趋严重,导致病原微生物、赤潮和海洋生物入侵等环境灾害频发,造成生态环境破坏和退化现象。建设海洋强国和推动海洋生态文明建设需要建立在海洋环境监测基础之上;海洋环境监测是深刻认识和了解海洋的重要手段,直接影响着我国海洋环境保护和海洋资源可持续利用与发展。
为了满足国家的需求,不断丰富监测内容和创新监测方法。随着分子生物学技术的迅速发展,基于生物基因的微观监测方法在海洋环境监测中也有广泛运用空间和利用价值。跟以往类似综述文章相比,本文更加全面介绍了分子生物学技术在海洋环境监测中的运用,特别在污染物分析方面,作者结合本人研究成果概述了相关研究进展。因此,本文涉及的分子生物学技术主要有克隆文库、变形梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrphoreses,DGGE)、环介导等温扩增(Loopmediated isothermal amplification,LAMP)、实时定量PCR(Realtime quantitative PCR,q PCR)、限制性片段长度多态性(Restrictive fragment length polymorphism,RFLP)、核酸探针和基因芯片(Microarray)等技术方法,期望通过这些分子生物学技术为海洋环境监测的研究与发展提供借鉴。
2 浮游植物
在海洋浮游植物监测过程中,通过显微镜对其定量计数和鉴定是海洋监测的常规方法。显微镜观察浮游植物会经常会遇到以下问题:(1)浮游植物鉴定需要有丰富分类经验的专业工作者才能分析,使得很多实验室不能开展这项工作;(2)有些浮游植物的形态非常相似,仅采用显微镜鉴定比较困难。例如,链状亚历山大藻和塔马亚历山大藻细胞形态就非常相似,仅在顶孔板形状、后连接孔位置和腹孔等处有微小差异[2]。东海原甲藻和具齿原甲藻是否为同一种的争论[3–4];(3)部分浮游植物为群体生活的种类,显微镜计数比较困难,例如拟菱形藻和棕囊藻。随着对分离藻种鉴定的不断深入研究发现,利用藻体中存在一些特异的功能基因可以分析浮游植物,如:核糖体基因(ribosomal DNA gene,r DNA)、核酮糖1,5—二磷酸羧化/氧化酶大亚基基因(rbc L基因)和贝类毒素基因(sxt基因)等。
核糖体基因中的18S、5.8S和28S r DNA基因具有结构功能保守和进化速度较慢的特点被广泛作为区别不同属浮游植物的一个分子指标;然而,核糖体基因中的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列为选择压力小而变异速率快的高变区域,且其序列变化与进化距离相适应,具有保守区与高变区镶嵌的特点,是区别同属不同种浮游植物的一个很好分子指标[5]。因此,核糖体基因常作为鉴定浮游植物的一个有力证据。Bornet等[6]根据r DNA基因序列来鉴别形态学上不易识别的有毒多列伪菱形藻和无毒尖刺伪菱形藻。黄健等[7]利用ITS基因和5.8S r DNA基因对分离于青岛胶州湾的两株疑似亚历山大藻进行准确鉴定。刘晨临等[8]提出利用核糖体小亚基和ITS核酸序列标记的方法可作为鉴定我国海域的亚历山大藻塔玛复合种的常规手段。通过核糖体基因对浮游植物进行鉴定是一种可靠的分析方法,是鉴定和纠正物种分类等方面必不可少的分析内容。
研究浮游植物群落结构时,rbc L基因可作为显微镜常规鉴定的一种辅助手段。Li等[9]采用rbc L基因通过克隆文库方法分析了北太平洋Subtropical Gyre中的浮游植物群落,发现该区域中的浮游植物主要为硅藻、甲藻、Pelagophytes和Prymnesiophytes,其中以硅藻最多。刘永健等[10]同样采用rbc L基因分析了胶州湾表层海水中浮游植物群落,发现该区域中隐藻、定鞭藻和Stramenopies占优势,而红藻和绿藻所占比例较少。
赤潮藻是海洋环境监测中重点关注内容之一,特别是一些能产生毒素的藻类。贝类毒素(saxitoxins,STX)是一种主要由Alexandrium spp.,Pyrodinium bahamense和Gymnodinium catenatum产生的毒素。研究者最近发现sxt A基因是参与浮游植物合成STX的关键基因。Murray等[11]根据浮游植物中sxt基因建立了q PCR方法,并运用于环境样品中Alexandrium catenella的监测。根据sxt A基因来分析赤潮藻是一种便捷分析方法。q PCR技术具有极高的灵敏性、特异性和快速性,在赤潮藻检测中获得了广泛应用。表1总结了国内最近利用该技术运用于海洋环境中赤潮藻监测。国外关于赤潮藻的q PCR监测报道则相对较多,已成功用于几十种赤潮藻的监测,如甲藻、定鞭藻、Pelagophyceae和硅藻等[12]。浮游植物的q PCR监测方面的应用尚处于起步阶段,主要大批量分析样品时具有一定局限性,q PCR技术需要制备高质量的DNA样品,而很多浮游生物的DNA纯化效率低,有时甚至根本就无法进行纯化[5]。
3 海洋病原微生物
海洋环境中存在多种对海洋生物及人体健康具有危害的病原微生物。目前已经确定能严重危害人和海水养殖动物的重要致病微生物主要包括细菌、病毒和寄生虫,但破坏海洋生态系统和对海洋环境污染做出响应的细菌主要是弧菌[19–20]。鉴于目前已发现的可培养微生物占到总微生物种类数的比例较小,以及病毒需要依赖于宿主生物的特点,本部分主要介绍分子生物学技术在海洋弧菌和病毒监测中的运用。
3.1 弧菌
弧菌是一类革兰氏阴性杆菌几乎来源于海洋环境。海洋弧菌已从20年前Vibrio和Photobacterium两属所含的20余种,增加为目前Enterovibrio,Grimontia,Photobacterium,Salinovibrio和Vibrio五属所含共约80种[21–22]。弧菌也被证实是海水鱼、虾、贝类和人体的常见致病菌。已知可能感染鱼或人类,并造成病害的海洋弧菌大约有20种,其中可能引起人类疾病的有12种。其中,又以Vibrio cholerae(霍乱弧菌),Vibrio parahaemolyticus(副溶血弧菌)和Vibrio vulnificus(创伤弧菌)最为重要,该3类弧菌对人体有很强的致病性[21,23–24]。目前国内关于弧菌的海洋监测方法通常是将样品中能生长在固体选择性培养基-硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(TCBS培养基)上的菌群数等同于弧菌数。这种方法目前被认为不太科学,一方面原因是不仅弧菌还有其他的一些细菌类群如:发光杆菌属、希瓦氏属、屈挠杆菌属、假单胞菌属等都可在TCBS培养基中生长,TCBS培养基并不是特异性非常强的弧菌选择性培养基[25];另一方面原因是寡营养条件下很多的弧菌处于活的但不可培养状态,因此通过传统的分离培养方法是监测不到这类弧菌[22]。然而,分子生物学技术可以避免上述的问题。
根据16S r RNA基因设计弧菌的特异性引物可以直接分析海洋环境中弧菌的微生物群落。Eiler和Bertilsson[22]根据弧菌16S r RNA基因采用DGGE方法分析了波罗的海和斯卡格拉克海峡水体中的弧菌,发现两地的弧菌类群大约为2到6大类,且两地的弧菌群落组成明显不同。霍颖异等[23]则通过克隆文库的方法分析发现舟山远洋船舶压载水中存在多种对人和动植物有害的病原弧菌(副溶血性弧菌和费氏弧菌)。孙颖[26]设计了3对扩增弧菌16S r RNA基因的引物,且发现引物(VF27和VR744)对海洋弧菌具有高度特异性能恰当的覆盖海洋弧菌各类群。该对引物是扩增海水中弧菌16S r RNA的较理想引物;并利用这对引物分析发现胶州湾表层水体中存在多种弧菌,以类灿烂弧菌菌群为优势类群。尽管在上述研究基于16S r RNA基因进行弧菌PCR扩增时存在部分非特异性的扩增产物,这是由于弧菌内16S r RNA基因序列高度相似,并且该基因的PCR扩增产物长度有限,从而通过该基因很难细致区分弧菌中成员。
弧菌在进化过程中不断从外界获得有利于在宿主体内定居与繁殖的遗传因子,从而发展成具有毒力基因或者相关基因的毒力株或致病株[27]。现在已知的弧菌毒力基因种类繁多,并且不同的致病弧菌所携带的毒力基因会有所差别。因此,根据这些毒力基因的定性和定量监测就可以了解海水养殖和海洋环境海产品中所含致病弧菌的群落组成。前面介绍对人体致病性最强的为霍乱弧菌、副溶血弧菌和创伤弧菌,表2列举了分子生物学技术针对以上三类弧菌毒力基因在海洋环境和海产品安全方面的运用。从表3中可以看出副溶血弧菌最主要的毒力基因为耐热直接溶血素基因(tdh基因)和相对耐热直接溶血素基因(trh基因);霍乱肠毒素基因(ctx基因)则是霍乱弧菌主要的毒力基因;创伤弧菌尽管目前的致病机制不是很清楚,但研究者认为溶血素基因(vvh基因)是创伤弧菌的重要毒力基因。毒力基因而且可以在种间和株间进行水平转移,有研究发现通过船舶的压舱水与水产品的进出口等多种途径很容易造成毒力基因的地域性转移,从而可能使当地某些无毒株转变为有毒株[27]。因此,在海洋环境监测过程中,可通过分子生物学技术全面掌握病原性弧菌的毒力基因在重要海洋敏感区的分布状况。
3.2 病毒
病毒被认为是海洋水体中数量最多的生物体,丰度高达1010L-1,是原核生物(细菌和古菌)丰度的5—25倍;病毒生物量则仅次于原核生物为第二大生物量组分;但是,由病毒引起的海水养殖生物的病害常有报道[36–37]。分子生物学技术可以利用病毒基因组序列,从分子水平上反映海洋环境中浮游病毒、人类传染病病毒和海水养殖生物的病害病毒的群落组成以其动态变化。
分析浮游病毒的分子生态分布时,高恶斌和王子乾[38]认为病毒的结构蛋白基因g20、DNA聚合酶基因和辅助代谢基因等序列是合适于浮游病毒检测分析的标记基因,可应用于浮游病毒多样性监测。Clerissi等[39]就利用DNA聚合酶基因采用宏基因组结合第二代454测序方法探讨了地中海Prasinovirus的时空分布。对于海洋环境中的人类传染病病毒,明红霞等[40]采用细胞培养结合q PCR方法监测了天津近岸海域4个季节中表层海水肠道病毒,发现夏季和秋季肠道病毒浓度较高,其次为秋季和冬季;基因序列分析发现该海域肠道病毒主要是脊髓灰质炎I型疫苗株。樊景凤[20]建立了检测甲肝病毒的“RT-PCR扩增-聚丙烯酞胺凝胶电泳-银染色方法”,并将该方法检测辽东湾海域海水和贝类体内甲肝病毒的分布。对于海水养殖区,更多关注的是鱼类病害病毒检测方法的建立,如:核酸探针技术、LAMP技术和RT-q PCR技术等[41–43]。
4 海洋入侵生物
外来海洋物种入侵已成为继海洋栖息地破坏之后世界海洋生态环境面临的第二个重大威胁。我国对于海洋生物入侵的研究还较薄弱,目前主要研究探讨的是一些已建立种群的入侵种分布、入侵途径和相关的防治措施介绍[44]。外来生物入侵包括引入、逃逸、种群建立和危害四个阶段,而且每相邻两阶段约有10%的物种可以成功存活[45–46]。生物入侵种在引入的初期可能都经历一个较难检测时期,一般手段根本无法对其进行检测;而经过那段较长的潜伏期后,当入侵种被发现后已具有相当规模,并且很难再控制消除[45–46]。因此,防止生物入侵扩散的关键在于引入和逃逸两阶段的防控。海洋生物早期发育阶段的卵和浮游幼体形态变化迅速并且种间形态差异较小。在早期采用传统形态学分析很难发现入侵生物,而基于生物DNA序列差异的生物技术在监测早期的生物入侵时具有很好优势[47–48]。Darling和Blum[47]提出根据监测样品的复杂性、监测目标的专一性和监测生物是否需要定量这三个要求,可以选择不同的分子生物学技术方法。确定海洋环境中是否存在已知特定的生物入侵种时,设计专门针对这一物种的引物进行PCR就能达到目标[47,49]。Harvey等[50]根据Heteroconchia,Pteriomorpha,Eumalacostraca,Pleocyemata和Ascidiacea各自r DNA基因间隔区序列的差异,然后设计特异性引物分析Puget Sound中本地种和入侵种的分布。监测低丰度的浮游生物幼体时,q PCR方法是种有效方法[48]。Smith等[51]根据18S r DNA基因序列采用q PCR方法监测了新西兰Tasman湾中亚洲蛤的生物入侵情况,发现在10 g沉积物中就能检测到1个浮游幼体,而在水体中没有发现该物种。监测复杂样品中入侵生物多样性时,基因芯片技术运用较多,但是该类方法目前主要运用于微生物的监测[47]。我国对于入侵生物的早期监测研究缺乏,有效开展生物入侵监测技术为控制有害外来种具有重要意义。
5 其他海洋生物
传统形态学性状的多样性实际上是生物分子性状多样性的反映,两者之间的关系是表型与基因型之间的关系。前面介绍了分子生物学技术在鉴定浮游植物、微生物和入侵生物中的运用。该技术而且能用于浮游动物、鱼类和珊瑚等的起源、分类与系统进化关系等研究。编码线粒体细胞色素C氧化酶第一亚基的mt COI基因作为DNA条形码成功用于桡足类、磷虾类、介型类、端足类、毛颚类、枝角类、浮游软体动物、刺胞动物和栉水母等类群的快速鉴定[52]。DNA条形码是使用标准化的DNA标记进行物种准确鉴定的技术,像商品的条形码一样建立DNA标记与物种信息之间的一一对应关系[53]。DNA条形码(mt COI基因)也有成功分析南极海域浮游动物[54]和南海海域金线鱼[55]的系统进化关系。Li等[56]根据mt COI基因、16S r RNA以及形态学特征区别了了织纹螺科中几种螺的进化关系。刘丽等[57]则利用mt COI基因、16S r RNA和mt SSU三种基因对广东徐闻地区常见的6科10属17种石珊瑚的21个样本进行分子系统学分析。在鱼类的分子鉴定过程中,细胞色素b基因也常用于鲷[58]和石斑鱼[59]等的系统进化关系分析。李渊等[60]根据叶绿体的mat K、rbc L和核糖体ITS基因采用PCR分析方法对采自爱尔兰、日本、韩国和中国的4种海草(大叶藻、矮大叶藻、丛生大叶藻和红须根虾形藻)进行亲缘关系比较。
6 污染物
随着我国对海洋资源的开发利用和沿海各省经济的快速发展,多种污染物通过自然作用(尘降、地表径流、降雨)、生物以及人类开发等途径进入到海洋,使得海洋成为各类污染物的最终“汇”集地。快速监测海洋污染物并对其毒性进行科学评价,成为当今环境科学关心的热点问题[61]。海洋污染物对生物体的作用最早必然从个体的分子水平开始,然后逐步在细胞、器官、个体、种群、群落和生态系统各个水平上反映出来[62]。因此,由基因表达的酶活性异常能够反映污染物早期毒性作用的生物分子标记物在海洋环境监测中具有很大的应用价值。
目前国内关于生物分子标记物研究主要集中在实验室内单一污染物胁迫下受试生物体中生物标记物的筛选。已有研究最多的污染物为重金属和石油类两大类,而与之相对应的特异性生物标记物基因常为金属硫蛋白基因(重金属)和细胞色素P450基因(石油类)[61,63–64]。除此之外,重金属胁迫下海洋双壳类动物体中的热激蛋白基因和抗氧化防御系统基因也有用于生物标记物监测的可能[64]。例如,刘慧慧等[65]利用q PCR技术研究了铜和镉胁迫后谷胱甘肽S转移酶基因(GST)在厚壳贻贝血液中的表达水平,指出厚壳贻贝GST基因可作为海水养殖环境污染监测的生物指示基因。以此同时,关于环境激素污染下卵黄蛋白原基因和有机磷污染下乙酰胆碱酯酶基因用于海洋环境污染指示的研究也有报道[61]。在生物分子标记物筛选中还需考虑不同分子生物学技术对研究结果的影响。莫正平等[62]利用LAMP技术和q PCR技术分别检测了原油WSF暴露褐菖鲉1 d后HSC70基因的表达水平,结果q PCR技术的灵敏度更高。因此,生物分子标记物研究需考虑污染物胁迫下时间-效应和剂量-效应的敏感性和特异性问题。
通过实验室对生物分子标记物的初步筛选后,将其运用于野外环境中污染物的预警与评估将是今后研究重点。该类研究在国内海洋环境中运用相对较少。安立会等[66]采用q PCR方法分析发现渤海南戴河野生梭鱼金属硫蛋白基因(Metallothionein,MT)的表达水平明显高于大神堂野生梭鱼的表达水平;同时,南戴河中该类鱼体的重金属残留水平要高于大神堂;因而认为梭鱼MT基因是监测海洋重金属污染的一类生物标志物。目前野外环境中的受试生物一般选择鱼类作为模式生物,主要由于鱼类处在海洋环境中较高的食物链端;而海洋环境中其他的一些鸟类、两栖类和海洋哺乳类的遗传特性和污染物毒性机制不太清楚,使得它们作为模式生物具有一定的局限性[67]。国外针对自然环境中污染物采用生物分子标记物的评价方法也主要是关于重金属和多环芳烃类的监测,例如:南极洲Trematomus bernacchii体内CYP1A基因作为指示环境中PAHs污染[68],以及地中海海岸Lithognathus mormyrus体内MT基因作为指示Cd污染的生物标志物[69]等。
目前有研究发现基于微生物功能基因的检测也能反映出海洋环境中污染物状况。作者采用克隆文库方法发现珠江口中具有PAH羟化双加氧酶(PAH-RHD)基因的微生物多样性与环境中PAHs污染水平具有正相关性,PAH—RHD可以做为PAHs污染的生物标志物[70]。很多研究通过q PCR方法同样发现这一规律,表现为环境中PAHs污染水平越高,微生物PAH-RHD基因拷贝数越高[71]。以此同时,有研究发现自然环境中微生物的抗生素抗性基因与环境中的抗生素含量也具有正相关性。Chen等[72]采用q PCR方法定量分析珠江口沉积物和水体中微生物tec基因丰度,并发现tec基因丰度与抗生素具有很好的相关性(相关性均大于0.73),而且沉积物中该相关性要高于水体;另外,夏季和冬季的季节变化对这一相关性影响不大。梁惜梅等[73]分析珠江口5个水产养殖区沉积物中抗生素总含量(磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗生素之和)与微生物中相应污染物抗性基因丰度之间也存在显着的正相关性(P<0.05);此外,微生物体中的整合子(int1基因)丰度也能指示珠江口养殖区中抗生素污染。
生物标志物在海洋环境监测中的应用仍处于起步阶段,有关研究结果大多是定性描述,而没有达到定量的研究水平。基于这个层次的分析,可以将生物标志物加入到生态系统健康评价中,这将是一项非常有意义的研究工作。在污染物对海洋生态系统潜在危害的评估和预测过程中,可以考虑选择表征不同种类污染物的生物标志物加入到评价体系中。以往国内对生态系统的评价主要从两方面考虑,一方面直接测定水质、沉积物或生物体中的各种污染物含量;另一方面通过调查该区域的海洋生物种类和数量的变化。原来的这种评价方法往往不能直接反映污染物对生物体或生物群落产生的直接影响作用。因此,基于生物标志物的监测方法在今后海洋生态系统的健康评价中将发挥重要作用。
7 展望
尽管目前有研究表明分子生物学技术能用于海洋环境监测,并且有其自身的优越性也有部分成功的例子,但是要广泛采用分子技术用于环境监测仍有一段距离。首先,分子生物学分析方法还是需要人工去野外进行采样然后带回实验室进行样品分析,这个过程需要花费几小时到几天的时间。对于一些海洋突发事件,最理想的监测是能实时了解事件发展状况,比如:赤潮预报就需清楚浮游植物的种群动态变化。但是目前没有能在野外现场进行实时分析的分子生物学技术。其次,PCR技术还有其自身需要克服的关键问题。高质量模板的获取非常重要,任何分子生物学技术研究前提都需要高质量和高含量的DNA或RNA样品。如果提取样品模板质量和含量较差,采用最先进的分子技术手段也无法获得满意结果,提取模板应该尽量减少抑制PCR扩增的物质含量。另外,合适的引物能减少PCR过程带来的假阳性产物;在PCR过程中也需防止对优势种群的放大效应,从而减少对低微物种数量的掩盖问题产生。因此,PCR实验过程也是影响分子生物学技术在环境监测运用的一个重要问题。再者,随着对监测能力提高的要求,需要采取的监测方法能满足简单而高效的特点。然而,相对于简便的传统显微镜检等方法,目前很多的分子技术手段花费的经费较高。随着测序技术、基因芯片和生物信息学等的发展,分子生物学技术将在实用和高效等方面将有突破。另外,任何一种分子生物学技术都存在一定的局限性,也不可能解决所有问题。这就要求多学科交叉,将分子生物技术和化学分析、形态学分析和统计学等方法结合,然后综合运用到海洋环境监测中,才能最终阐明海洋生态问题为保护海洋提供技术支撑。
参考文献
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