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摘要：产前诊断是预防遗传病患儿出生的主要途径。随着分子生物学技术的迅猛发展, 相应产生了分子细胞生物学的新技术, 这些技术包括荧光原位杂交技术 (FISH) 、定量荧光聚合酶链式反应 (QF-PCR) 、引物原位标记技术 (PRINS) 等。本文对这些分子生物学方法在产前诊断中的应用作一综述。
关键词：产前诊断; 分子生物学技术; 遗传学;
产前诊断又称宫内诊断, 是近代医学遗传学与临床医学相结合而发展起来的一门新兴学科。它是通过直接或间接的方法对孕期胎儿情况进行检测, 了解胎儿在子宫内的健康状况, 有无遗传病或先天性畸形, 继而采取一些必要的措施预防严重遗传病, 先天性畸形和智力障碍患儿的出生, 从而提高出生人口的素质, 是预防性优生学的重要组成部分。
传统的产前诊断途径采用胎儿细胞进行遗传学分析获得染色体核型。其有检测周期长、标本培养后易污染等缺点[1]。随着分子生物学技术的迅猛发展, 相应产生了分子细胞生物学的新技术, 这些技术包括荧光原位杂交技术 (FISH) 、定量荧光聚合酶链式反应 (QF-PCR) 、引物原位标记技术 (PRINS) 等。分子生物学的兴起使得我们对一些具有严重出生缺陷或者遗传病等问题在宫内期即可作出诊断并及时采取科学合理的对策措施。现将对这些分子生物学方法在产前诊断中的应用作一综述。
1 荧光原位杂交 (FISH)
FISH是以荧光标记单链核苷酸为探针, 与待测样本的单链核苷酸进行原位杂交, 形成的杂交双链核酸在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数[2]。据研究报道[3], 它弥补了经典显带法不足, 具有快速、灵敏、可靠的特点, 可较精确地测定各种染色体数目和结构畸变, 较染色体核型分析省时省力, 因此, 在基因定位、染色体数目和结构异常等研究领域得到广泛的应用[4]。但该技术步骤繁琐, 取材时间有限, 细胞培养耗时长, 可能会发生污染导致培养失败, 细胞质量要求高, 技术水平要求高。
Lee[5]等利用特异性的探针运用FISH的方法检测未经培养的羊水细胞, 检出一例嵌合型DS, 该胎儿生后表现出典型的DS特征。此项研究结果证实了FISH可以作为常规核型分析的补充, 用于检测未经培养的羊水细胞, 特别是一些超声有异常发现的病例。Elias[6]小组和Ganshirt[7]小组分别报道了他们对从孕母血分离的患儿有核红细胞进行的FISH检测, 细胞显示3个杂交信号的百分率一般较低, 分别为2.8%~74%和10%~17%, Elias将三体信号百分率为74%的标本的FISH的结果与其羊水穿刺及流产胎儿组织染色体核型对比, 证实确为21三体, 进一步分析证实该例检测时为流产早期, 母血流中存在较多胎儿三体细胞, 因此三体信号百分率相对较高。Suhubert[8]等和黄艳仪[9]等研究证明FISH技术也可应用于Down综合征诊断领域。朱俊真[10]等采用不用经过培养的绒毛、羊水细胞直接应用FISH分析, 尤其是其建立的一标二区FISH直接检测染色体及间期细胞, 选用X、Y、13、18、21号特异性探针, 首先做培养后染色体和未经培养的绒毛、羊水细胞对照试验, 和对就诊的孕妇中的130例高危孕妇, 成功地进行产前诊断, 结果显示, 在绒毛组织正常核型标本细胞中FISH呈现2个杂交信号, 信号显示范围90%~99%, 平均为98.6%。羊水细胞在正常核型FISH呈现范围为91%~98%, 平均为96.2%。Bianchi[11]用转铁蛋白受体 (TFR) 的单克隆抗体分选富集胎儿细胞 (TFR存在于胎儿有核红细胞上, 而母体细胞尚无此受体) , 同时用特异性Y染色体探针和21号染色体探针同时进行荧光原位杂交。结果TFR阴性细胞中显示2个21号染色体信号而无Y染色体信号, 证实为母体细胞;TFR阳性细胞中发现3个21号染色体信号和1个Y染色体信号, 证实该孕妇怀有21三体男性胎儿。但是富集过程中胎儿细胞的丢失, 母血细胞的污染, 操作的复杂, 费用的昂贵等问题尚未解决。
2 定量荧光聚合酶链式反应 (QF-PCR)
该技术[12,13]是在PCR反应系统中加入荧光标记的特异性探针, PCR扩增DNA样本, 据相关软件检测后判断出其是何种引物扩增的标志物及该标志物指示的染色体数目[14]。该技术具有灵敏度较高、无创伤、简单、快速、特异度高、成本较低、取材方便等优点[15]。但对于易位型、嵌合型染色体三体, 异常核型细胞数较少时可能会漏诊[16]。
Lee等[17]应用4个位于21号染色体上的STR作为遗传标记, 利用定量荧光聚合酶链式反应 (QF-PCR) 对221例未经培养的羊水细胞进行DS诊断, 敏感性、特异度和有效诊断率分别为95.4%, 100%和99.5%。QF-PCR能利用母体外周血中的胎儿红细胞诊断21三体[18], 其结果显示, 随着被分析的STRs标记的数目的增加, 诊断非整倍体的统计学概率会随之升高。如果只使用一种21号染色体的STRs标记, 那么PCR对于那些同一的母胎等位基因是无意义的。但是如果多个靶位点被扩增, 那么荧光峰值的位置和强度就因为峰的重叠而变得难以分析, 因此在他们的研究中选择了2-3个21号染色体STR标记。Cha等[19]从9位因胎儿染色体异常终止妊娠妇女的外周血中分离胎儿有核红细胞进行D18S535基因PCR扩增成功, 并成功诊断出1例18三体, 该方法不但可减少由传统的羊膜腔穿刺、绒毛活检或脐静脉穿刺引起的不良反应, 并且突破了进行羊膜腔穿刺及绒毛活检的妊娠周数的限制。
3 引物原位标记技术 (PRINS)
引物原位标记是一种将PCR与FISH结合的分子细胞遗传学技术, 由Koch等于***年首先建立, 其基本原理是将未标记的寡核苷酸探针与已变性的染色体特定部位杂交, 在DNA聚合酶作用下, 在染色体玻片原位以标记的脱氧核甘酸为原料, 于合适的温度进行链的延伸, 合成含有标记的DNA链。合成的新链通过相应的检测系统检测。PRINS与FISH技术相比, 具有特异性高、快速、准确、经济、重复性好的优点[20], 在判断染色体数目方面有明显的优势, 即使染色体形态不佳, 也可以根据信号直接得出结论。
Mennicke等[21]用PRINS检测262个未培养羊水细胞间期18号、X和Y染色体, 结果与用FISH方法分析结果相一致。PRINS技术的操作较FISH更为快速简捷, 整个实验在4~5小时内即可完成, 所采用的寡核苷酸引物不象FISH那样需进行复杂的探针制备价格低廉, 更适宜在国内推广应用。但对标本要求较高, 反应条件不易掌握, 且需要专门的仪器进行反应。
综上所述, 各种方法各有优劣, 相互之间仍无法代替。因此, 寻找一种快速、准确、安全的产前诊断方法仍是一项重要的课题。
参考文献
[1]Caine A, Naltby A E, Parkin C A, et al.Prenatal detection of Down’syndrome by rapid aneuploidy testing for chromosomes 13, 18, 21 by FISH or PCR without a full karyotype:A cytogenetic risk assessment[J].Lancet, 2005, 366:123-128.
[2]Karen S, Andre VS, Inge I.Preimplantation genetic diagnosis[J].Lancet, 2004, 47 (3) :297-303.
[3]Xiao HM, Tan YQ, Li LY, et al.Prenatal diagnosis of common chromosomal aneuploidies on uncultured amniotic fluid cells by fluorescence in situ hybridization[J].Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 2004, 21 (6) :608-610.
[4]Luke S et al.Cell Veton, 1997;4 (1) :16-31.
[5]Lee J, Stanley JR, Vaz SA, et al.Downsyndrome with pure partial trisomy 21q22 due to a patemal insertion (4;21) uncovered by uncultured amniotic fluid interphase FISH[J].Am J Med Genet A, 2005, 132 (2) :206-208.
[6]Elias S et al.Ann NY Acad Sci, 1994, 731:80-91.
[7]Ganshirt I, et al.Ann NY Acad Sci, 1994, 731:103-114.
[8]Suhubert R, Raff K, Schwanitz G.Molecular-cytogenetic investigations of ten term placentae in cases of prenatally diagnosed mosaicism[J].Prenat Diagn, 1996, 16:907-913.
[9]黄艳仪, 孙筱放, 黎青, 等.应用荧光原位杂交技术诊断羊水细胞染色体异常[J].中华妇产科杂志, 1999, 34 (3) :153-155.
[10]朱俊真, 余小平, 楚伟, 等.荧光原位杂交技术与应用研究行快速产前诊断[J].中国优生与遗传杂志, 2005, 13 (10) :41-42.