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摘 要： 利用微生物分离提纯技术得到1株高活性甲烷氧化菌, 并通过合理构建微生物菌液降解静态高浓度甲烷实验环境, 定量检测分析降解过程中甲烷消耗和甲醛生成的一般规律。实验结果反映, 在降解过程的前7 d, 甲烷消耗和甲醛生成速率随着降解时间推移而增大, 且甲烷消耗量大于甲醛生成量;甲烷消耗速率和甲醛生成速率在第7 d达最大, 在8～14 d之间先有下降趋势, 最后趋于平稳。
关键词： 甲烷氧化菌; 降解过程; 甲烷消耗; 甲醛生成; 煤与瓦斯突出;
Abstract： A highly active methane oxidizing bacteria by microorganism separation and purification technology is obtained.Through constructing the environment for the degradation of static high concentration methane by microbial solution, the general laws of methane consumption and formaldehyde production in the process of degradation were analyzed quantitatively.The experimental results reflected that methane consumption rate and formation rate of formaldehyde increased during the first 7 days, and methane consumption was more than formaldehyde production;the methane consumption and formation rate of formaldehyde reached the highest on the 7 d, and there was a downward trend between the 8th and 14th days, and finally they tended to be stable.
Keyword： methane oxidizing bacteria; degradation process; methane consumption; formaldehyde generation; coal and gas outburst;
据报道, 我国煤矿事故多由井下瓦斯引起[1,2,3,4]。以往针对井下瓦斯采取的预防措施主要有:瓦斯监测监控、风排瓦斯、预抽瓦斯等。近些年, 随着矿井采掘深度不断增加, 采掘应力显着升高, 煤层瓦斯浓度呈快速增大趋势, 而透气性系数则越来越低, 致使传统的多种瓦斯治理手段在不同程度上都显现了一定的局限性。此情形下, 越来越多的专家学者开始尝试在新的领域-微生物治理煤矿瓦斯理论和技术进行探索和研究工作[5]。
该项理论和技术思想自1939年被提出后, 澳大利亚研究人员从自然生境中分离纯化出甲烷氧化菌, 然后将甲烷氧化菌菌液喷洒到煤壁, 发现巷道中甲烷浓度下降了66%[6,7];美国研究人员驯化出一种名为贝耶林克氏的甲烷氧化菌, 该菌是从酸性沼泽中分离出来, 具有极强的耐酸性, 能够降解掉一定范围内大气中的90%甲烷气体。我国学者余海霞、张瑞林等在甲烷氧化菌降解瓦斯技术方面也进行了相关研究, 通过不同的实验, 先后验证了甲烷氧化菌在一定条件下具有有效降解瓦斯的能力, 其中张瑞林教授模拟了甲烷氧化菌降解煤层瓦斯实验, 证实了微生物对井下甲烷有有效的氧化降解能力, 为微生物治理矿井煤层瓦斯提供了有力的依据[8,9]。我国学者夏仕文、李树本等从光谱学角度研究了甲烷单加氧酶的几种中间化合物, 推进了甲烷氧化菌氧化机理的研究[10,11]。2015年研究人员郝江、常红端等研究了混合的甲烷氧化菌的发酵放大特性, 为克服甲烷氧化菌生长缓慢提供理论依据[12]。但需要高度警惕的是, 据文献报道[13]微生物降解瓦斯过程中生成一定量的甲醛, 甲醛无色有刺激性气味, 毒性较高, 易溶于水, 居于我国有毒化学品优先控制名单第2位, 是1种极强的致癌物, 对人体危害极大。基于此, 通过开展微生物降解甲烷实验, 严密跟踪检测降解过程中相关指标数据, 分析了该过程中甲烷消耗和甲醛生成的一般规律及其相互之间的关系, 以期为优化、完善微生物降解煤矿瓦斯理论和技术体系, 并有效控制降解过程中具有危害性的甲醛等中间产物。
1 实验材料与设备
1.1 实验材料
取下水道淤泥泥样10 g, 培养基参考闵航在培养能够降解甲烷的微生物时用的无机盐培养基[14], 其中铜离子浓度修改为0.000 15 g/L, 其它为蒸馏水和无菌水, 厌氧袋, 甲烷气体, 氧气气体, 橡皮管, 封透膜, 报纸, 橡皮筋, 凡士林、封口膜, 培养瓶, 强力夹等。
1) 固体培养基。固体培养基的制备是在液体培养基中加入2%的琼脂粉, 微波加热1 min后, 进行高压灭菌, 然后倒平板制成。
2) 溶液。测甲醛生成量 (即菌液中甲醛含量) 时所需溶液较多, 1 mol/L硫酸溶液、乙酰丙酮溶液、0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液、1 mol/L氢氧化钠溶液、0.1 mol/L碘溶液、36%~40%甲醛溶液。
1.2 实验设备
实验设备主要包括752N紫外可见分光光度计、MCG-3000型便携式气象色谱仪、SW-CJ-1F单人双面超净工作台、LDZM-600KCSII高压灭菌锅、超声波细胞破碎及煤矿井下气体配置实验装置。
煤矿井下气体配置实验装置也叫高压混气装置 (图1) 。该装置可将氧气、氮气、甲烷任意2种或3种气体以不同比例精确混合而成, 可为微生物构建不同气相环境, 从而多方面多角度研究微生物。该装置主要有高压钢瓶、压力表、针型阀、触摸显示控制器组成;3个高压钢瓶是由耐高压不锈钢制成, 用于储存O2、N2、CH4;钢瓶上安装有压力表和高压针型阀制作而成的控制阀, 分别用于检测瓶内气体压力和控制气体流量。
装置主要优点:设备可通过甲烷大流量质流计和小流量质流计, 2种量程的质流计组合, 按照设定气体成分比例, 准确的将气体混合, 精确度高且高度自动化;每路气体在质流计输出后连接防爆单向阀, 装置顶部装有防爆风机, 开机模式下自动向外排出内部气体, 避免内部有气体聚集, 极大提高了设备安全性能;装置采用混气管, 可使气体混合充分。
图1 高压混气装置
2 微生物的纯化及其降解甲烷效能实验
2.1 厌氧型甲烷氧化菌的分离与纯化
将泥样溶解于50 mL蒸馏水中, 溶解充分后密封静置8 h, 得到菌悬液。选用120 mL医用输液瓶, 注入40 mL的培养基进行细菌富集培养。实验过程中, 用注射器将培养瓶内液面上部气相置换20 mL纯甲烷, 为细菌代谢提供碳源。培养过程中pH设置为6.5, 温度为30℃[15]。
多次转接实验后, 利用微生物菌种分离技术进行分离实验, 得到单菌落。利用所得单菌落进行甲烷降解实验, 对能利用甲烷为唯一碳源的细菌进行革兰氏染色, 光学显微镜下观察呈红色, 与已有文献报道的甲烷氧化菌为革兰氏阴性菌的特征相符合[16], 然后利用分光光度计检测菌株活性, 最终遴选得到一株高活性甲烷氧化菌。
2.2 微生物降解甲烷效能实验
共设4组实验, 每组14个培养瓶, 分别标记1、2、3、…、14, 其中3组为实验组, 1组为空白试验。向实验组的培养瓶中注入扩大培养至第4 d的菌液1mL, 用大量程注射器向培养瓶中一次性置换20 mL甲烷气体, 封口膜密封放入恒温摇床培养, 温度设为30℃, 转速设为120 r/min。采用气相色谱法测定甲烷浓度, 乙酰丙酮法检测甲醛的生成量[17,18], 每隔24 h, 检测1次, 做好数据记录, 然后利用excel软件进行数据分析。
3 菌液甲醛含量的测定
3.1 标准曲线的绘制
吸取3 mL的36%~40%甲醛溶液于量筒, 加蒸馏水稀释至100 mL, 取稀释后甲醛溶液10 mL于300 mL三角瓶内, 然后加入50 mL的0.1 mol/L碘溶液和15 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液, 加蒸馏水90 mL, 振荡使其充分混合, 静置20 min;加入25 mL配置好的1 mol/L硫酸溶液, 然后用0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液滴定。同时做空白试验。计算出实验室甲醛溶液的浓度为417 mg/L, 用蒸馏水稀释成0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95、1.0、1.05mg/L的甲醛标准使用液。
取上述各浓度甲醛溶液6 m L, 加入6 m L乙酰丙酮溶液, 振荡, 沸水浴20 min, 放入避光处冷却, 用分光光度计于波长412 nm测量各浓度甲醛溶液的吸光度, 以甲醛标准使用液浓度为纵坐标, 分光光度计测得吸光度为横坐标, 绘制标准曲线 (图2) 。
图2 标准曲线
3.2 样品甲醛测定
将样品置于超声波细胞破碎仪中进行细胞破碎, 然后滤纸过滤, 取过滤液6 mL加入6 mL乙酰丙酮溶液, 按照上述操作步骤, 冷却后用水相过滤, 取过滤液, 测吸光度, 从标准曲线中查找菌液中甲醛的含量。
3.3 实验结果
检测发现空白对照组中甲烷浓度没有变化, 培养基中甲醛含量为0。取3组实验数据平均值, 得培养瓶中的甲烷浓度和甲醛生成量 (即菌液中甲醛含量) (表1) 。甲烷浓度变化曲线如图3, 甲醛含量变化曲线如图4。
根据理想状态方程, 计算得出每隔24 h消耗甲烷的质量和甲醛的生成质量 (表2) 。
4 结果分析
根据实验结果可知, 培养瓶中甲烷一直呈下降趋势, 1~3 d期间甲烷浓度下降速率缓慢, 但呈上升趋势, 甲醛含量呈缓慢上升趋势, 因为这期间甲烷氧化菌处于适应培养环境阶段, 此阶段细菌生长缓慢, 活菌数目较少, 但呈上升趋势导致;4~7 d之间, 甲烷消耗和甲醛生成量逐渐加快且增幅度大, 在第7 d甲烷消耗和甲醛生成量都达到, 其中甲醛最大生成量为0.88 mg/L, 这是因为甲烷氧化菌适应培养环境, 进入数期生长期, 生长繁殖速度快, 活菌数目短期内快速增长, 利用了较多的甲烷, 在第7 d时活菌数目达最达值所致;在8~11 d时, 甲烷浓度平稳下降, 甲醛生成量变化幅度较小, 这期间甲烷氧化菌进入稳定期, 活菌数目变幅较小, 在一定时间段内保持稳定, 所以甲烷浓度平稳下降, 产生的甲醛量也趋于稳定;12~14 d期间甲烷浓度依然呈下降趋势, 但是下降速率缓慢, 甲醛生成有所下降, 因为此时培养基中营养成分减少, 有毒有害物质增多, 细菌活性下降且活菌数目迅速减少导致。
表1 甲烷浓度和甲醛生成量
图3 甲烷浓度变化曲线
图4 甲醛含量变化曲线
表2 甲烷消耗质量和甲醛生成质量
5 结论
1) 利用微生物分离提纯技术得到一株高活性甲烷氧化菌, 并构建合理的微生物菌液降解静态高浓度甲烷实验环境。
2) 甲烷氧化菌降解甲烷实验表明, 甲烷氧化菌培养至第7 d, 甲烷消耗速率最大, 甲醛生成量最多, 在1个培养周期14 d内, 甲烷浓度变化规律符合曲线y=0.181 7x2-5.622 6x+59.203 (R2=0.968 5) , 甲醛生成规律符合曲线y=-0.007 4x2+0.111 5x+0.421 7 (R2=0.908 7) 。
3) 通过检测分析证明, 甲烷的消耗量大于甲醛生成量, 说明甲烷在被降解过程中只有部分转化为甲醛。
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