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Abstract：A carbon fiber nanoelectrode (CFNE) was prepared using the flame-etching method. Scanning electron microscopy and cyclic voltammetry were used to characterize its diameter and the electrochemical properties, respectively. Differential pulse voltammetry was used to detect dopamine (DA) in vitro. A patch clamp in the voltage-clamp mode was used to monitor the release of DA from PC12 cells after stimulation with an elevated K+solution, maintaining the voltage at 700 mV. The results showed that CFNE was successfully prepared with a diameter of ～100 nm, and excellent nonlinear diffusion behavior was observed on the nanoelectrode surface. Further, the nanoelectrode showed excellent response to DA with the limit of detection of 10 pmol/L. After PC12 cells were stimulated with the elevated K+ solution, the DA release process of PC12 cells at a single release site was monitored in real time.
Keyword：Carbon fiber nanoelectrode; Neuron-like cell; Single release site; Dopamine; Real-time monitoring;
多巴胺 (DA) 是一种儿茶酚胺类的神经递质小分子, 通过在神经细胞间进行物质传输和信息传递来实现脑功能的正常发挥。DA的正常释放与否严重影响着人们的各种生理心理活动, 当DA的释放过程出现故障时, 人们可能会出现各种异常行为, 轻者可能出现失眠、抑郁等症状, 重者可能会患帕金森综合症等难以根治的疾病[1]。此外, 很多外在因素严重影响着DA相关受体的表达, 有研究表明, 电离辐射影响小鼠胸腺中多巴胺羟化酶及β2受体m RNA的表达[2,3]。因此, 在细胞水平上来实时监测神经递质的释放对实现一些神经类疾病的早诊断早治疗有很重要的指导意义。
电化学技术因其快速、灵敏等特点受到研究者的广泛关注[4,5]。同时, 电化学可以灵活地与其他纳米材料结合以提高其传感性能, 例如, DNA纳米材料由于其优良的稳定性和可编程性, 被广泛地研究和应用[6,7,8,9,10,11,12]。因此, 电化学方法是对囊泡进行实时监测的主流方法。自从Adams课题组[13]首次采用碳纤维微电极在大脑中检测到胺类神经递质以来, 微电极被认为是研究神经科学和脑科学最有效的工具。随后, 研究者采用微电极在细胞水平上研究神经递质的释放, 并对囊泡的释放机制进行分析[14,15,16,17,18,19,20,21,22,23]。但是这些研究均采用微电极进行, 测定结果可能是多个释放位点的释放情况。在一定程度上不能真正反映单个释放位点的释放情况, 因此, 对于囊泡释放机制的分析解读可能存在一定误差。此外, 微米电极尺寸过大, 也不适合实现突触间隙中神经递质的检测。在本工作中, 我们采用火焰刻蚀法制备了直径低至100 nm的碳纤维纳米电极 (Carbon fiber nanoelectrode, CFNE) , 实时监测了类神经细胞PC12表面单个释放位点的DA释放过程。
1、材料与方法
1.1、试剂与仪器
铜丝 (直径0.5 mm) 、玻璃毛细管 (长80 mm, 直径0.9~1.1 mm) 、丙酮、乙醇、氯化钠、硫酸、氯化镁、磷酸氢二钠、铁氰化钾、氯化钾、4-羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES) 、氯化钙、磷酸二氢钠等无机试剂均购买于国药集团试剂有限公司;碳纤维 (直径7μm) 购于Toray Industries (日本) ;DA购于西格玛奥德里奇 (上海) 贸易有限公司;石墨烯导电胶 (Ted Pella) 购于上海普迈生物科技有限公司;RP1640培养基、胎牛血清FBS (Gibco) 、链霉素、青霉素、谷氨酰胺购于英潍捷基 (上海) 贸易有限公司;环氧树脂购于北京中镜科仪技术有限公司。
细胞外液:140 mmol/L NaCl、2 mmol/L CaCl2、4.2 mmol/L KCl、0.7 mmol/L MgCl2、1 mmol/L Na H2PO4、10 mmol/L HEPES, pH=7.4。高钾刺激液:50 mmol/L NaCl、80 mmol/L KCl、2 mmol/L CaCl2、0.7 mmol/L MgCl2、1 mmol/L NaH2PO4、10mmol/L HEPES, pH=7.4。
CHI 760E电化学工作站 (上海辰华) ;扫描电子显微镜 (JEOL, 日本电子公司, 日本) ;P-2000毛细管拉制仪 (Sutter, 美国) ;CellTram vario油压式 (带齿轮) 显微注射仪 (Eppendorf) ;显微操纵器 (Eppendorf) ;Multiclamp700B膜片钳 (东乐自然基因生命科学有限公司) 。
1.2、碳纤维纳米电极的制备
参考文献方法[24], 首先将碳纤维在丙酮、乙醇、超纯水里面分别超声30 min, 随后, 将碳纤维置于37 oC烘箱中烘干备用。采用p-2000毛细管拉制仪拉制毛细管直径至约20μm, 将碳纤维通过石墨烯导电胶与铜丝连接, 待导电胶干燥, 将此连接好的碳纤维插入拉制好的毛细管中, 保证碳纤维在尖端伸出1 mm左右, 毛细管末端采用环氧树脂胶固定包封2 h, 采用酒精灯将毛细管尖端玻璃熔化进行尖端包封, 随后对碳纤维进行刻蚀, 通过控制火焰温度和刻蚀时间实现对电极尖端尺寸的调控。
1.3、碳纤维纳米电极的电化学表征
配制含有0.5 mol/L KCl的10 mmol/L K3Fe (CN) 6, 采用三电极系统 (碳纤维电极为工作电极, Ag/AgCl为参比电极 (3 mol/L KCl) , Pt为对电极) 扫循环伏安曲线, 扫描范围为-0.2~0.5 V, 扫描速度0.1 V/s。
1.4、DA体外检测
首先对细胞外液通氮气进行除氧处理, 随后配制10 mmol/L的DA溶液, 采用同样的三电极系统, 选用差分脉冲伏安法检测不同浓度DA溶液, 扫描范围为-0.2~0.5 V, 增幅0.05 V。
1.5、PC12细胞培养
PC12细胞在37 oC含5%CO2的培养箱中进行培养, 选用RP-1640培养基, 其中含10%胎牛血清、5%青霉素、5%链霉素, 采用中板进行铺板, 细胞数5万~6万, 保证大部分细胞以单细胞形式分散, 铺板过夜, 采用细胞外液清洗3次, 随后进行细胞实时监测实验。
1.6、PC12细胞释放DA实时监测
将Multiclamp700B打开预热30 min, 以Ag/AgCl为参比电极, 采用显微操纵器将电极和显微注射针移至细胞附近, 采用电压钳模式, 保持电压700 mV, 采用Gap free模式, 对施加高钾刺激的细胞进行实时监测。
2、结果与讨论
2.1、碳纤维纳米电极的表征
碳纤维纳米电极结构及组成如图1 (a) 所示;扫描电子显微镜扫描结果如图1 (b) 所示;电化学表征结果如图1 (c) 所示。对碳纤维进行火焰刻蚀以后, 电极表面仍然比较平整, 尖端直径可低至100 nm左右。在K3Fe (CN) 6溶液中扫描循环伏安曲线, 我们得到S型的稳态伏安曲线, 说明在该电极表面存在着微/纳电极特有的非线性扩散的特性。
图1 碳纤维纳米电极的制备与表征
2.2、DA的体外检测
采用背景信号低的差分脉冲伏安法验证CFNE对DA的体外响应。结果如图2 (a) 所示, 在约0.14 V时检测到DA的氧化电流信号, 而且该电流信号的峰值随DA浓度递增而增大。根据检测限为空白信号平均值加3倍空白信号标准差这一测定方法, 我们得到CFNE对DA的体外检测限低至10 pmol/L。有文献报道, 细胞内囊泡中DA浓度最高可达0.11mol/L[25]。CFNE在体外对DA的检测限比此数值低1 000倍, 因此, 可以用于细胞释放DA的实时监测。图2 (b) 为CFNE检测DA的标准曲线, 曲线呈现很好的S型, 在一定浓度范围内, 纳米电极对DA有很好的浓度响应, 当DA浓度达到100μmol/L时, 电流信号达到饱和。
图2 碳纤维纳米电极检测DA的体外响应
2.3、PC12细胞释放DA的实时监测
实时监测PC12细胞释放DA的实验原理图如图3 (a) 所示。对细胞施加高钾刺激, 引起钙离子内流, 进一步导致细胞膜的去极化, 产生动作电位。伴随这一过程, 细胞胞内囊泡往细胞膜迁移、锚定、最终发生融合, 释放DA。在电极上施加700 mV的电压, 如果纳米电极放置位置刚好处在囊泡释放位点, 则可实时监测到囊泡释放的DA。图3 (b) 所示为实时监测过程中, 显微注射针和纳米电极放置位置。显微注射针和纳米电极分别置于细胞两侧, 防止刺激液流出时对电极产生扰动而产生干扰信号。图3 (c) 所示为对PC12细胞施加高钾刺激以后, 实时监测到的DA释放结果。我们监测到了多个电流尖峰信号, 每个尖峰信号对应一个囊泡的量子释放。与之前文献报道的微电极监测结果不同[26], 该纳米电极监测到的电流尖峰更分散, 没有复杂的多个尖峰信号同时出现的情况。由于神经细胞膜上存在多个囊泡释放位点, 这些释放位点在细胞膜上的分布存在不均匀性。采用微米电极进行监测的时候, 由于电极尺寸很大, 监测范围内可能存在只有一个释放位点的情况, 但也有可能存在多个囊泡释放位点的情况。因此, 以微电极监测到的结果对细胞囊泡释放机理进行解释存在一定的统计学意义, 与实际单个囊泡释放位点释放情况存在一定误差。采用纳米电极进行实时监测可以有效解决这一问题, CFNE监测结果是针对单个释放位点释放的情况, 可以更好地应用于囊泡释放模式或释放机制的研究分析。
图3 实时监测PC12细胞释放DA
3、结论
采用火焰刻蚀法将碳纤维电极尺寸降至100nm左右, 以减少实验过程中电极监测范围内含有多个囊泡释放位点的情况, 更好地应用于囊泡的释放模式研究。首先对该纳米电极在体外检测DA响应情况进行验证, 结果表明, 该纳米电极在体外对DA的检测限可达10 pmol/L, 低于胞内囊泡中DA浓度的1 000倍。因此, 从检测灵敏度角度来看, 该纳米电极在实时监测细胞释放DA的研究中有很大的应用潜力。
与之前采用微电极实时监测细胞释放DA结果相比[25], 采用纳米电极测到的电流尖峰明显减少, 且呈单峰分散状态分布。说明纳米电极所监测的范围内囊泡释放位点明显减少, 大部分只含有一个囊泡释放位点。因此, 采用纳米电极研究分析囊泡释放模式更准确。此外, 将该纳米电极插入到神经细胞突出间隙进行研究, 可以在更深层次上研究细胞释放机制, 有利于更好地认识和理解细胞间的物质传递和信息传导, 最终有助于实现某些神经类疾病的诊断和治疗。
参考文献
[1] Damier P, Hirsch E C, Agid Y, et al.The substantia nigra of the human brain-II.Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease[J].Brain, 1999, 122 (8) :1437-1448.DOI:10.1093/brain/122.8.1437.
[2]刘林林, 田梅, 傅海清, 等.电离辐射对小鼠胸腺中多巴胺羟化酶及β2受体m RNA表达的影响[J].吉林大学学报 (医学版) , 2003, 29 (2) :128-130.LIU Linlin, TIAN Mei, FU Haiqing, et al.Effect of ionizing radiation on DBH m RNA andβ2-AR m RNAexpressions in thymus in mice[J].Journal of Jilin University (Medicine Edition) , 2003, 29 (2) :128-130.
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