穿越仙剑之逍遥后宫,西王母是谁,哆啦a梦100周年特别篇
血液成分在体外储存过程中会发生一系列的生理生化、形态结构及其功能变化, 称为“储存损伤”。血小板 (Platele, Plt) 是从骨髓成熟巨核细胞裂解脱落下来最小的血细胞, 呈现双面微突的圆盘状[1], 随着体外储存时间的延长, 其形状和生物功能不断发生变化, 包括圆盘状结构消失, 形态由双面凸形向球形转变、树枝突起及伪足生成, 导致血小板膜糖蛋白的改变, 进而影响其聚集功能[2]。此外, 血小板在保存过程中不断的代谢导致耗氧增加, 乳酸大量堆积、酸度升高、pH下降, 进而导致血小板活化、其颗粒分泌异常及其凋亡[3]。储存损伤是如何影响机采血小板凋亡及其聚集功能的, 及其二者之间的关系如何?本研究探究储存损伤对机采血小板凋亡及其聚集功能的影响。
材料和方法
试剂与仪器
血小板凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC/PI购自Ebioscience公司 (美国) ;腺苷酸二磷酸盐 (denosine diphosphate, ADP) 、胶原 (collagen) 、凝血酶受体激活肽-6 (thrombin receptor-activating peptide-6, TRAP) 及花生四烯酸 (arachidonic acid, ASPI) PBS洗液均购自Sigma公司 (美国) ;FACSVerse流式细胞仪及Cellquest软件购自Bectonand Dickinson公司 (美国) ;多功能细胞分析仪Mindary BC-6800购自迈瑞公司 (深圳) 。
样本处理
本实验收集健康成年人机采血小板10例, 血型为O型、男性, 平均年龄33.8±5.7 (23-55) 岁。将收集的机采血小板放置于血小板保存袋中, 每袋机采血小板含量大于2.5×1011/200 ml, 白细胞混入量≤5.0×108/袋, 红细胞混入量≤8.0×109/袋, 在22℃环境下振荡保存, 分别在机采血小板保存的d 2、5、8于超净台取样后进行检测。
血小板计数
分别在机采血小板保存的第2、5和8 d于超净台取血小板0.5 ml, 利用多功能细胞分析仪 (Mindary BC-6800) 检测血小板数, 并检测机采血小板中白细胞和红细胞数, 以确认实验过程中是否有白细胞或红细胞的影响。
机采血小板凋亡比率检测
取第2、5、8 d机采血小板进行凋亡细胞检测。检测试剂为Annexin V-FITC/PI试剂盒, 各样本检测具体操作步骤如下:取机采血小板10μl, 每管加入200μl binding buffer稀释液, 重悬血小板;混匀后加入5μl Annexin V-FITC试剂, 室温避光孵育15 min。于实验管加入10μl PI试剂后, 立即上FACSVerse流式细胞仪进行检测, 检测完毕后, 使用Cellquest软件收集数据和分析细胞凋亡情况。
血小板聚集活性检测 (电阻抗法集合度测定法)
通过多功能细胞分析仪, 在体外分析并检测10份供者机采血小板在不同时间点分别对激活剂ADP、Collagen、TRAP及ASPI聚集活性的变化。用PBS稀释液将供者血小板的浓度稀释至500×109/L, 然后加入测试孔中。将血容积作为参考点, 使不同时间点的读数和变化之间的差异标准化。在对ADP, collagen及TRAP的聚集活性实验中, 先将机采血小板与0.9%NaCl (含3 mmol/L CaCl2) 溶液按1∶1的比例混匀后孵育3 min;而对ASPI聚集活性实验中, 先将机采血小板与0.9%NaCl溶液按1∶1的比例混匀后孵育3 min;孵育结束后, 分别加入浓度为6.5μmol/L ADP、3.2μg/ml collagen、32μmol/L TRAP、0.5 mmol/L ASPI。上机检测其在6 min内的聚集情况变化[4]。
统计学分析
利用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计, 统计结果以均数±标准差 (±SD) 表示, P<0.05为差异有统计学意义。
结果
血小板计数分析
在进行流式细胞术检测及血小板聚集功能分析前, 计数分析显示, Plt、WBC和RBC分别为≥0.9×109/ml、≤1.00×104/ml和≤2.00×107/ml, 以确保实验结果不受白细胞、红细胞等细胞的干扰。
储存机采血小板的凋亡变化
对储存机采血小板的凋亡分析发现, 与对照组相比, 储存机采血小板凋亡细胞百分比随时间的推移而逐渐增高, 第2 d凋亡率为 (2.87±0.31) %, 第5 d为 (11.08±1.54) %, 储存至第8 d时凋亡比百分率可达 (27.99±2.76) %, 显示各实验组的凋亡细胞百分比显着升高, 且有一定的时间依赖性 (F=14.32, P<0.01) (图1) 。
储存机采血小板在各种激活剂的诱导下聚集功能的变化
我们在不同的时间点检测了10份供者机采血小板在激活剂ADP、Collagen、TRAP及ASPI诱导下聚集功能的变化。结果表明, 与储存第2 d的机采血小板相比, 存储第5 d的机采血小板在Collagen、TRAP及ASPI诱导下聚集功能显着减弱 (P<0.01) 。与储存第2 d和5 d的机采血小板相比, 存储第8 d的机采血小板对Collagen、TRAP及ASPI诱导下聚集功能减弱更为显着 (P<0.01) 。然而, 当用激活剂ADP进行激活诱导时, 储存第2、5及8 d的机采血小板聚集功能的减弱无差异 (P>0.05) (图2, 表1) 。
Figure 1.Changes of platelet apoptosis by flow cytometry.**P0.01.
Figure 2.Dot plots depicting the donor variation in the aggregation response**P0.01.
储存机采血小板的凋亡与其聚集功能相关回归分析
分别在第2、5、8 d检测机采血小板的凋亡细胞百分比, 以及其在各种激活剂诱导下的聚集情况, 然后进行相关回归分析结果显示, 血小板凋亡细胞百分比与ADP、Collagen、TRAP、ASPI处理组聚集集落数的相关系数r值分别为-0.9497、-0.9527、-0.9707和-0.9352, 即机采血小板的凋亡情况与其聚集功能密切相关, 且关联性较强;回归性分析结果表明:R2分别为0.9019、0.9077、0.9019和0.8746, 即用机采血小板的凋亡情况来估算其聚集功能的可靠性较高 (图3) 。
讨论
早期研究证实血小板在体外保存5 d后, 回输人体仍可存活5-7 d。目前血小板体外保存时限仍沿用1986年时制定5 d的国际标准。血小板在体内的生成受血小板生成素 (thrombopoietin, TPO) 调节, 正常血小板存活时间经51Cr标记测定为8-11 d[5]。血小板在保存过程中, 由于不断的代谢消耗, 乳酸大量堆积、酸度升高、pH下降, 进而导致血小板活化、颗粒分泌异常, 进而促进其凋亡的发生[3]。细胞凋亡时会将磷脂酰丝氨酸移至膜外, Annexin V易于结合磷脂类如磷脂酰丝氨酸, 后者用于细胞的凋亡检测。但磷脂酰丝氨酸转移到细胞膜外并不是凋亡独有的特征, 也可发生于坏死的细胞。由于碘化丙啶 (PI) 对具有完整细胞膜的活细胞和早期凋亡的细胞拒染, 而对丧失膜完整性的晚期凋亡细胞及坏死的细胞则易染, 因此, Annexin V结合PI双染可用于鉴别凋亡细胞的细胞[6]。本研究通过对储存机采血小板的凋亡分析发现, 与对照组相比, 储存机采血小板的凋亡细胞百分比随时间的推移而逐渐增高, 且有一定的时间依赖性。
Table 1.Response of Plt aggregation to stimulation in different times
Figure 3.Correlation regression analysis between apoptosis and aggregation function of platelets
血小板在凝血和止血中起重要作用。血小板通过黏附于受伤的血管壁暴露的皮下组织, 血小板经皮下组织的胶原纤维结合蛋白以及凝血酶等激活后, 发生变形、释放和聚集等一系列反应, 起到初期止血的作用。在各种诱导剂的作用下, 血小板将其内容物释放, 并在血浆纤维蛋白原的参与下形成白色血栓。此外, 血小板还在血液凝固过程、促使血块收缩、维护血管内皮完整性过程中起重要作用。血液成分在体外储存过程中会发生一系列的生理生化、形态结构及其功能变化, 称为“储存损伤”[7]。血小板随着体外储存时间的延长, 其形状和生物功能不断发生变化, 包括圆盘状结构消失, 形态由双面凸形向球形转变、形成树枝突起及伪足生成, 导致血小板膜糖蛋白发生改变, 进而影响其聚集功能[4,8]。本研究通过对机采血小板的聚集功能分析发现, 随着储存时间的延长, 10份供者机采血小板在激活剂Collagen、TRAP及ASPI诱导下的聚集功能不断下降。与储存第2 d机采血小板相比, 存储第5和8 d的机采血小板在Collagen、TRAP及ASPI诱导下聚集功能显着减弱, 当用激活剂ADP进行激活诱导时, 储存第2、5及8 d机采血小板聚集功能的减弱并无差异。此外, 除ADP以外存储第5和8 d的机采血小板对Collagen、TRAP及ASPI诱导激活的速率亦显着减低。
此外, 本研究对第2、5、8 d机采血小板的凋亡细胞百分比以及其在各种激活剂诱导下的聚集情况进行了相关和回归分析。相关分析结果显示, 血小板凋亡细胞百分比与其聚集功能密切相关, 关联性较强;回归性分析显示, 用机采血小板的凋亡情况来估算其聚集功能的可靠性亦较高, 即随着机采血小板储存时间的延长其凋亡细胞百分比逐渐升高, 其聚集功能逐渐减弱, 且其聚集功能的降低与其凋亡比例的升高是密不可分的。本研究明确了机采血小板在22±2℃的储存条件下血小板凋亡及其聚集功能的变化, 以及血小板凋亡与其聚集功能的关系, 这为延长血小板保存时间, 缓解临床血小板紧张奠定理论基础。这些研究有利于对储存期间血小板输注质量的保证和加强血小板保存期间的损伤作用机制研究, 并有望最终运用于临床工作, 缓解目前的血小板紧张问题。
参考文献
[1] Vasudevan S, Steitz JA.AU-rich-element-mediated upregulation of translation by FXR1 and Argonaute 2.Cell, 2007;128 (6) :1105-1118.
[2]戴凯, 张洪为.单采血小板保存期内聚集功能的变化研究.医学信息, 2014;36:409-409.
[3]刘棋, 温振科, 焦淑贤, 等.海藻糖对液态低温保存机采血小板凋亡的影响.中华检验医学杂志, 2009;32 (11) :1282-1284.
[4] Baimukanova G, Miyazawa B, Potter DR, et al.Platelets regulate vascular endothelial stability:assessing the storage lesion and donor variability of apheresis platelets.Transfusion, 2016;56 (Suppl 1) :S65-75.
[5]熊文, 竺展坤, 邬旭群, 等.贮存血小板形态变化与凋亡因子磷脂酰丝氨酸表达的研究.中国输血杂志, 2007;20 (6) :476-479.
[6] Michelson AD.How platelets work:platelet function and dysfunction.J Thromb Thrombolysis, 2003;16 (1-2) :7-12.