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摘要：基于现代分子生物学技术对白酒酿造微生物的研究, 阐述了研究白酒酿造微生物所运用的现代分子生物学技术的各种方法, 包括PCR克隆文库技术、PCR-变性梯度凝胶电泳、单链构象多态性扩增技术、核酸探针原位杂交技术、实时荧光定量PCR技术、高通量测序技术等及其相应原理, 并且综述了近年来现代分子生物学技术手段分别在大曲、窖泥、酒醅微生物中的应用研究进展, 对深入研究微生物与酒体风味形成之间的关系奠定了基础。
关键词：现代分子生物学技术; 白酒酿造微生物; 鉴定; 检测; 微生物群落结构;
人们熟知的现代世界六大蒸馏酒分别是白兰地 (Brandy) 、威士忌 (Whisky) 、伏特加 (Vodka) 、金酒 (Gin) 、朗姆酒 (Rum) 、中国白酒 (Baijiu) 。其中, 中国白酒是我国特有的一种蒸馏酒, 中国白酒的酿造是采用含有淀粉或糖质的原料, 并以酒曲作为酿酒的糖化发酵剂, 发酵后经蒸馏、勾调等工艺制成[1]。白酒酿造过程中微生物群落呈现复杂多样性, 而发酵过程中微生物的菌群结构的变化, 很大程度上对白酒的产量与质量均起着决定性的作用。随着人们对酿酒微生物研究的深入, 酿造过程中的主要微生物正在逐步被人们揭示。近年来, 因现代分子生物学的快速、准确、灵敏等特点, 对于白酒微生物的研究已经从传统的分离培养转向分子生物学研究, 运用现代分子生物学技术手段为白酒酿造微生物群落的深入发展提供了重要的研究方向。本文基于现代分子生物学技术, 对白酒酿造微生物的研究及进展进行了综述。
1 白酒酿造微生物研究中所运用的现代分子生物学技术方法及其原理
1.1 PCR克隆文库技术
克隆文库技术可分析样品中微生物的种类及其相应比例, 通过该技术检测实验室内无法培养的微生物, 再对文库中的基因序列进行测定, 获得样品中所含基因的种类和相对数量[2]。目前PCR克隆文库技术已经广泛应用于环境微生物的相关研究, 常用的是核糖体RNA基因克隆文库的构建, 主要包括16S r DNA基因克隆文库、真菌18S r DNA基因克隆文库以及真菌ITS基因克隆文库。2008年, 张守印等[3]使用16S r DNA克隆文库对细菌群落分析的可靠性进行了研究, 结果表明使用该技术手段可以反映出菌群中各种细菌的丰度。
PCR克隆技术的基本原理:使用PCR扩增目的基因片段将扩增片段导入载体, 再将载体导入宿主细胞 (如感受态的E.Coli) , 经平板培养筛选目的克隆, 再转接培养目的克隆进行扩大培养, 然后提取载体DNA, 经限制性内切酶处理后再经核酸电泳确认, 最后测定目的片段的序列, 获得系统发育信息[4-5]。PCR克隆文库技术能获得微生物的准确基因序列信息, 可检测出微生物群落中的优势菌群。
1.2 PCR-变性梯度凝胶电泳 (PCR-DGGE)
PCR-DGGE技术是当今分子生物学分析中最常用的分析方法之一, 是研究环境微生物群落结构的重要手段, 已经在海洋微生物和土壤微生物中得到应用广泛[6-7]。该技术具有准确、高效、简便, 能全面反映样品微生物多样性等优点, 并可获悉微生物的动态群落的变化。DGGE的设计原理:根据双链DNA碱基序列中GC含量及对应的熔解Tm值均不同。DGGE法是在聚丙烯酰胺中形成变性剂梯度 (如加入甲酰胺或尿素) , 使用特定引物PCR扩增相同长度的目的片段, 电泳时GC含量低的先变性, 含量高的后变形, 根据其变性后迁移速度不同, 把GC含量不同的核酸分离出来[5]。PCR-DG-GE的技术原理[8]是环境样品DNA提取后经PCR扩增获得大量序列不同、长度一致的基因片段。DNA分子中4种碱基组成和排列具有差异性, 致使不同序列的双链DNA分子有不同的解链温度, 再经变性梯度凝胶电泳形成各异的条带, 随后把切胶回收后的条带序列与DGGE指纹图谱对比分析, 最终获得环境微生物群落结构的整体信息。
1.3 单链构象多态性扩增技术 (PCR-SSCP)
单链构象多态性技术 (SSCP) 是根据DNA构象差别来检测点突变的一种检测方法, 能够分离长度相同而序列不同的核酸片段。单链构象多态性技术所依据的原理是:相同长度的单链DNA, 因碱基序列不同, 形成的构象不同, 进而形成了单链构象的多态性。凝胶电泳中长度相同核苷酸序列不同的DNA的迁移率不同, 即可形成分离的条带, 因此在非变形聚丙烯酰胺凝胶中呈现不同的条带可被银染或者荧光标记引物检测, 最后用DNA自动测序进行分析, 可进行系统发育的研究。
用PCR-SSCP技术可以进行序列差异的测定, 但随着片段长度的增加, 检测的敏感度会降低。在PCR-SSCP技术中, 进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。基本过程[9]: (1) 提取样品基因组DNA; (2) 利用PCR扩增16S r DNA或18S r DNA特定区域; (3) 将特异的PCR扩增产物变性形成单链DNA; (4) 将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳; (5) 回收DNA, 进行基因测序, 同基因文库的16S r DNA或18S r DNA序列对比分析确定微生物的种属。
2 现代分子生物学技术在白酒酿造微生物中的应用
2.1 现代分子生物学技术在大曲微生物中的应用
大曲生产过程中产生的微生物具有多样性、复杂性特点, 也具有多酶多菌的特点。现代分子生物学技术在大曲微生物上的应用方面, 主要从对其鉴定、微生物检测及其群落结构分析方面着手, 其中对菌群的分析较多。胡佳等[19]利用免培养法, 通过提取大曲的细菌总DNA, 进行细菌16S r DNA序列的PCR扩增, 构建基因文库, 实验结果表明大曲具有高度的细菌多样性。随后在进一步解析中通过PCR克隆文库的一系列技术, 分别进行克隆分析、同源性比较以及系统发育树的构建, 发现大曲中检测到变形杆菌、假单胞菌等, 后对大曲中鉴定出的细菌类群中不可培养的微生物进行了部分解析[5]。褚学英等[20]从大曲中分离获得了7株酵母的26S r DNA的D1/D2区的基因序列, 运用PCR技术对大曲中主要酵母菌进行分子鉴定。其后, 惠丰立等[21]继续对该区域分别进行了序列分析和系统发育树的分析。
2009年, 罗惠波等[22]采用PCR-SSCP技术对浓香型大曲发酵过程中的原核微生物群落结构进行了研究, 实验过程中发现发酵各时期群落结构的相似性与多态性, 进行了一定的推测:不同生物群落彼此具有协同作用和相互制约效应。高亦豹[23]等采用PCR-DGGE图谱技术分别对高温大曲和中温大曲进行了细菌的群落解析, 检测出传统方法无法直接分离鉴定的细菌种属。2012年, 兰玉倩等[24]同样采用PCR-DGGE技术分析了清香型大曲生产过程中酵母菌的组成, 并发现了清香型大曲生产中各个阶段的优势菌。姚栗等[25]在探索高温大曲中细菌的种属分布以及细菌区系的构成情况时则运用了16S r DNA克隆文库技术。张磊等[26]结合传统方法和现代分子生物学方法中的18S r DNA序列分析技术, 对习酒大曲进行了较为系统的酵母菌鉴定。张霞等[27]也运用二者结合的方法对浓香型大曲中的霉菌进行了鉴定分析, 构建了系统发育树。刘效毅等[28]采用传统的分离方法和分子生物学相结合, 综合对高温大曲中的微生物进行了分离鉴定。张会敏等[29]通过构建16S r DNA克隆文库的方法, 研究分析了古井贡酒中温大曲和高温大曲细菌群落结构及其多样性, 并通过比较详细的分子鉴定了两种大曲中主要细菌的组成比例, 并研究了其相应的进化关系。陈玲等[30]则结合16S r DNA克隆文库法和高通量测序法, 对大曲中细菌微生物群落的组成及丰度和多样性进行了分析, 且对比了两种方法在研究大曲样品细菌多样性方面的适用性, 研究结果表明, 在反映样本微生物群落规模上两种方法的差异较大, 但在反映大曲样本中主要微生物的物种组成及数量比例上, 二者获得的结果较为接近, 尤其是通过两种方法获得样本中优势微生物类群的结果基本一致。
除以上主要常见的现代分子生物学技术之外, 还有一种宏基因组技术, 可直接对待测样品中所有微生物全基因组的DNA进行克隆。黄祖新等[31]利用宏基因组技术研究了大曲微生物中群落多样性及其变化规律, 较为全面地解析了大曲微生物的代谢机理, 进一步解析了利用大曲所生产的白酒的香味物质组成和风味特征的关系。
2.2 现代分子生物学技术在窖泥微生物中的应用
窖泥微生物种类繁多, 相对大曲而言窖泥的微生物菌系更为复杂, 近年来运用各种分子生物学技术研究白酒窖泥微生物的概况, 对于窖泥中细菌、古菌群落的定性和定量分析取得了一定成效, 对微生物其他菌群结构也进行了进一步分析。
对于泸州地区浓香型白酒窖泥原核微生物的群落结构, 叶光斌等[32]利用克隆文库法进行了研究, 检测出窖泥中的优势菌群, 测定了其含量。黄志国等[33]利用PCR-DGGE技术检测了泸州老窖酒厂中不同窖龄 (30年、100年、200年) 窖泥中细菌, 对比分析了细菌的丰度、多样性和相似性, 以及优势微生物的种类。甑攀等[34]运用PCR-SSPR技术解析了泸州老窖3种不同窖龄 (20年、100年、300年) 窖泥中细菌和古生菌的多样性和相似性。王明跃等[35]分别对20年窖、50年窖和150年窖中窖泥构建了细菌的16S r DNA克隆文库, 通过文库分析浓香型白酒窖泥细菌随窖龄的变化规律, 研究发现随着窖龄的增加, 窖泥细菌多样性指数呈增加的趋势, 其中20~50年之间变化幅度较大, 50年和150年窖泥的菌群结构相似性较高, 此外, 该研究对窖池细菌群落组成及与窖泥质量性状的关系进行了较为全面系统的分析。汤斌等[36]综合利用16S r D-NA、PCR扩增技术、分子克隆技术以及序列同源性分析等方法, 对安徽古井贡酒的窖泥进行分析, 结果表明, 古井窖泥中具有高度的细菌多样性。施思等[37]采用PCR-DGGE技术并结合生物信息学软件分析, 研究了浓香型白酒中不同窖泥的微生物群落特征分布, 结果表明, 实验过程中具有自然老熟的黑色窖池底泥中的细菌, 以及产甲烷古菌菌群随每一排次发酵进行, 其微生物区系的丰富性逐渐趋于稳定, 并且发现泸州老窖窖泥中的优势菌群是梭菌属中一些不可培养的Bacillus。
除克隆文库及DGGE技术之外, 其他分子技术也均有涉及到窖泥的微生物群落结构中的运用。张劲等[38]使用荧光定量PCR技术研究了3种不同窖龄的 (20年、50年、150年) 窖泥, 发现甲烷菌的数量及其变化规律, 并以此为窖泥的老熟程度提供了相关依据。刘琨毅[39]针对窖泥微生物的特殊性, 建立了窖泥微生物群落的PLFA指纹图谱。吴冬梅等[40]利用FISH技术进行了可视化定量表征窖泥中细菌和古菌的特征, 从而在细胞水平上研究了窖泥微生物群落。何翠荣等[41]对浓香型白酒窖池细菌和古菌随窖龄变化研究中采用了FISH技术, 研究中发现该技术为浓香型白酒窖池微生物群落结构的研究提供了一种快速、有效的检测手段。能较真实地反映出窖池中细菌与古菌的生长信息。其他现代生物学技术中, 如涉及到高通量测序技术的运用, 陶勇等[42]使用高通量测序技术 (NGS) 对窖泥中细菌和古菌群落进行检测, 解析了样品中的优势微生物类群及其差异性。邓依等[43]将ITS-AFLP指纹图谱技术应用到贵州某酒厂窖池池壁和池底的窖泥的分析, 研究发现, 池壁和池底窖泥中原核微生物呈现出差异性, 其中老窖池池底和新窖池池底的原核微生物多样性具有显着性差异, 而二者的池壁的原核微生物多样性差异性不大。
2.3 现代分子生物学技术在酒醅微生物中的应用
白酒生产酿造过程中具有“千年窖万年糟”说法的酒醅, 为窖泥微生物的生长提供物质能源, 是微生物生长的基质。酒醅微生物生长环境复杂, 传统的分离培养方法无法深入研究其微生物区系, 而采用现代分子生物学技术则可突破传统方法的局限性, 能够较为全面、客观快速的分析研究酒醅中微生物的群落结构。目前, 酒醅微生物中的应用所使用的现代分子生物学技术主要有基因文库、PCR-DGGE技术以及二者相结合的方式。张文学等[44]通过对酒醅发酵过程进行跟踪取样, 借助PCR扩增技术, 对窖池中心的酒醅样品进行DGGE和16S r DNA同源性比较, 研究发现, 发酵初期微生物分布呈现明显的多样性, 而整个酒醅发酵过程中, Lactobacillus属细菌较为突出, 随后通过18S r DNA克隆技术, 进行PCR扩增分析鉴定糟醅中真菌为优势菌, 研究结果表明, 糟醅中真菌优势菌群构成及其变化趋势与浓香型白酒糟醅发酵中大分子物质的降解、白酒风味物质的形成有着密切关系[45]。2007年, 张文学等[46]再次利用PCR-DGGE技术针对泸州老窖发酵过程中酒醅细菌和真菌群落结构进行了研究, 研究表明真菌多样性的变化规律是随着发酵过程的进行其多样性逐渐降低。
王海燕等[47]采用基因文库方法与PCR-DGGE技术结合, 对浓香型和芝麻香型两种类型白酒中微生物群落进行了多样性分析, 结果表明, 两种酒醅中的微生物种属结构有巨大的差异性。施思等[48]则利用PCR-DGGE及克隆技术对习酒酒醅入窖前后的菌群变化进行了分析, 结果表明, 发酵前微生物群落结构的分布有明显的多样性, 而发酵后优势菌群的改变较为显着。李德林等[49]利用PCR-DG-GE技术, 对浓香型白酒酒醅细菌群落DGGE图谱的相似性进行了分析, 研究发现各样品图谱间相似性指数较低, 对微生物群落结构有着较大影响的因素为季节及进水水质的不同。
唐洁[50]利用PCR-DGGE技术分别进行了酒醅中细菌、酵母和霉菌的群落组成的分析。研究结果表明, 清香型酒中主要的产酒酵母和产酯酵母分别是酿酒酵母 (S.cerceisiae) 和异常毕赤酵母 (P.anomala) 。黄治国等[51]利用PCR-DGGE技术对四川不同地区酱香型白酒酒醅细菌的群落结构进行了研究, 结果表明, 酱香型白酒酒醅细菌的群落结构因不同地区而出现较大的差异性。邵明凯等[52]则结合DGGE和RT-PCR技术, 分别对酱香型白酒发酵过程中酵母群落结构进行解析。曾驰等[53]对白云边酒高温堆积酒醅过程中分离出来的6株不同细菌进行了鉴定, 运用PCR技术对其进行了16S r DNA序列扩增、同源对比和系统发育分析, 研究发现白云边酒高温堆积酒醅过程中主要细菌为芽孢杆菌属 (Bacillus) 的细菌。
张霞等[54]通过对贵州浓香型白酒酒醅中分离的细菌, 运用16S r DNA序列分析, 结果表明, 地衣芽孢杆菌 (Bacillus Licheniformis) 为明显优势菌群, 占芽孢杆菌属总数的32.96%。LI X R等[55]结合16S r RNA文库、焦磷酸测序以及实时定量PCR技术, 跟踪分析了汾酒一个轮次夏季发酵酒醅, 发现其中超过16S r RNA基因总序列的91%属于乳酸杆菌科, 而乳酸杆菌科中51%的为耐酸乳酸杆菌, 并且检测到的化学成分有着相似的显着性变化, 此外, 其中60%真菌为酵母。刘念等[56]运用18S r D-NA序列同源性分析结合PCR扩增技术, 研究了浓香型白酒糟醅中酵母和丝状真菌的区系的菌群构成及演变规律, 结果发现, 在白酒糟醅中的真菌优势菌中, 上层糟醅比下层糟醅的菌群分布较为丰富, 发酵前中期和后期优势菌群则有不同。刘雯雯[57]基于26S r DNA序列分析, 跟踪了发酵周期过程中的菌群变化情况, 对黑龙江某酱香型酒醅中酵母菌进行了解析, 确定了其种类及群落结构。王海燕[58]综合了集中分析手段, 通过结合传统微生物研究方法、PCR-DGGE、QPCR、HS-SPME-GC-MS技术, 对清香型酒醅微生物进行了研究, 实验表明, 研究样品的主要微生物属在发酵后期乳杆菌为最优势细菌。除以上对酒醅微生物的研究中所提到的技术外, T-RFLP技术也应用于酒醅微生物的多样性研究中[59-60]。
3 总结与展望
中国白酒是我国传统的行业, 有着厚重的文化积淀和人文情怀, 是中华民族文明的象征。探究解密白酒酿造过程中微生物的重要作用及其环境微生物区系的生态变化规律, 对中国白酒的发展有着不可估量贡献。随着现代分子生物学技术的不断发展, 及其他相关技术的进一步结合, 对中国白酒生产中酿造微生物的应用更加广泛, 更加深入。现代分子生物学技术可在种属水平上对白酒酿造微生物进行系统分析, 可综合分析大曲、窖泥、酒醅中的微生物区系, 适用于整个环境微生物的菌群分析, 能进一步挖掘白酒酿造中的微生物菌种、菌群多样性、白酒风味物质特征分析等方面的研究, 对白酒实际生产不仅能提供深入的理论基础及指导方向, 为解决实际生产中面临的酿造微生物的难题而溯源, 也为创新传统模式下的白酒研发等方面提供更加具体详见的目标性, 为进一步推动中国白酒的快速强劲的发展提供巨大的技术支撑作用。
参考文献
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