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摘要：目前, 我国正处于H7N9禽流感病毒疫情高发季节。2017年春季以来, 我国福建、云南、湖南和湖北等16个省份均出现了感染H7N9的病例, 并且感染数量和范围与去年同期相比有明显上升和扩大。H7N9禽流感病毒因其对人类的高致死率和快速的传播速度引起了全球的广泛关注。快速、准确和高效的检测对H7N9禽流感的疫情监测和防控至关重要。为此, 该文就目前应用于H7N9禽流感病毒研究中的分子生物学诊断技术 (包括聚合酶链反应、基因芯片、依赖核酸序列的的扩增、高分辨率熔解曲线、液相芯片、重组酶介导的等温扩增法、高通量测序、环介导等温扩增及多重PCR-酶联免疫吸附法等) 进行了综述。
关键词：H7N9; 禽流感病毒; 分子生物学;
2013年3月中国报道了首例因感染新型甲型H7N9流感病毒而致死的病例, 引发疫情的H7N9禽流感病毒是一种鸟类的禽流感病毒毒株基因重配的新型病毒[1], 该病毒是首次从人群中发现的一种新型H7N9亚型禽流感病毒, 也是全球首次发现的新亚型流感病毒。禽流感是一种新亚型、起病急、进展快及致死率高等为特点的急性传染病, 新型H7N9病毒最显着的特征之一是在家禽中无明显致病性, 却能感染人类并引起较高的病死率。H7N9禽流感病毒检测是人感染H7N9禽流感防治的关键环节之一, 其病原学检测实验室要求高, 条件苛刻, 不易普遍实施[2]。分子生物学方法以其特异、灵敏和简便等特点, 克服了传统方法的局限性, 近年来发展迅速[3]。现就H7N9禽流感病毒的分子生物学诊断技术综述如下。
1 聚合酶链反应
聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 技术又称基因体外扩增技术, 是一种利用DNA变性与复性原理在体外进行特定DNA片段高效扩增的技术。1986年, PERDUE用PCR技术诊断禽流感, 从接种鸡胚到检测出结果仅用36 h。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速简便及重复性好等优点[4]。
1.1 RT-PCR
近几年发展起来的逆转录-聚合酶链式反应 (RT-PCR) 是目前发展最成熟的分子诊断技术, 基于MP和NP基因的高度保守区的引物, RT-PCR可鉴定禽流感病毒 (AIV) [5]。王云鹤等[6]通过对H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测, 证实该方法最低检出量为1.4×102.5EID50·m L-1, 并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段, 但试验也证实普通RT-PCR比荧光RT-PCR最低检出限低100倍, 敏感度存在一定差距。
1.2 荧光RT-PCR法
荧光RT-PCR技术是以标记特异性荧光探针为特点并集PCR和探针杂交技术为一体[7]。叶惠仪等[8]试验结果显示, 应用建立的荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原, H7体系可以检测到1:10-10抗原稀释度, N9体系能检测到1:10-9抗原稀释度, 且对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原及新城疫抗原无交叉反应, 重复性试验变异系数为1.13%。华哲云等[9]试验证实, 实时荧光RT-PCR能有效检出H7N9禽流感病毒核酸, 对于此次人感染H7N9禽流感病毒疫情的实验室检测也是首选的方法。
1.3 多重荧光RT-PCR
一步法多重RT-PCR是指在1个PCR反应体系中同时设立2对或2对以上的引物, 用于扩增不同的目的片段[10]。王国政等[11]以人细胞RNA酶P (RNase P) 基因为内参, 设计PCR特异性引物和探针建立四重荧光定量RT-PCR法, 结果显示:该方法检测甲型流感病毒 (Flu A) 、H7、N9与RNase P灵敏度均达102拷贝/ml, 特异性达100%, 每对引物和探针只检侧出相应的病毒, 无交叉反应, 检侧变异系数 (CV) 均低于1.55%。用该法检测1 896例临床标本, 结果Flu A 235例, H7N9 127例, 与其他试剂报告结果完全一致, 符合度达100%。罗宝正等[12]根据Gen Bank中公布的新型H7N9亚型 (2013年) 禽流感病毒血凝素抗原 (HA) 和神经氨酸酶抗原 (NA) 的基因序列, 设计两套特异性的引物和探针, 建立多重荧光RT-PCR法。结果表明, 该方法灵敏度高及特异性好, 能够检测到最低浓度为10拷贝/μl.数量级的阳性标准品, 不但能够将禽流感病毒H7亚型与其他亚型区分开, 并且可有效地将新型N9亚型病毒与原有的N9亚型区分开, 且通过实验证实, 该方法比普通RT-PCR检测方法的灵敏度高4个数量级。
2 基因芯片
基因芯片 (Gene Chip) 又称DNA微阵列 (DNA micro-array) 其主要原理是分子生物学中的核酸分子原位杂交技术, 即利用核酸分子碱基之间互补配对的原理, 通过各种技术手段将核苷酸固定到固体支持物上, 随后将处理好的样品与其进行杂交, 以实现对所测样品基因的大规模检验[13]。韩雪清等[14]根据H7亚型的基因序列, 设计特异性引物和探针, 制备了H7亚型禽流感病毒鉴定基因芯片, 利用收集自49个地区的2 653分标本进行评价, 显示该病毒基因芯片具有良好的特异性和敏感性。王慧煜等[15]通过试验证实, 基因芯片检测结果是可靠的, 可以用于临床样品的检测。但是实验需要昂贵的成本和较高的实验条件, 所以一般的实验室无法开展。
3 依赖核酸序列的扩增
依赖核酸序列的扩增技术 (nucleic acid sequencebased amplification, NASBA) 是一种扩增RNA的新技术, 是由一对引物介导的、连续均一的及体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程[16]。刘乐庭等[17]通过试验证实, NASBA技术通常仅需要4~6 h就可以准确地得到结果, 可准确无误地检出H7亚型禽流感病毒。NASBA技术具有特异性强、灵敏度高、反应迅速和操作简单等特点, 特异性和灵敏性均高于PCR, 使用的过程当中不需要PCR仪等特殊的设备, 只使用恒温水浴锅就可以完成整个扩增反应过程, 更适合基层实验室使用[18]。
4 高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解曲线 (high resolution melting, HRM) 是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析新技术, 具有极高的敏感性, 可以检测出单个碱基的差异, 并且成本低、通量高、速度快、结果准确及不受检测位点的局限, 实现了真正的闭管操作[19]。刘志成等[20]针对H7N9亚型 (AIV) HA和NA基因的相对保守区域, 设计了2对引物, 这2对引物特异性好、扩增效率高及相互干扰小, 在反应体系中加入饱和荧光染料Syto9, 并通过优化反应条件, 建立了基于HRM分析H7N9亚型AIV的检测方法。结果显示, 该方法特异性强, 其他常见禽源病毒及非H7亚型和非N9亚型的AIV不能形成特异熔解峰形;灵敏度高, 对H7和N9阳性质粒的最低检测限分别达到1.0×101拷贝/μl和1.0×100拷贝/μl;重复性好, 熔解峰Tm1和Tm2的批内和批间变异系数均<1%;临床样本检测与某商品化H7N9亚型AIV定量PCR检测试剂盒比较, 符合率为100%。该方法可用于H7N9亚型流感病毒的临床筛查和监测。
5 液相芯片
液相芯片技术是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的芯片技术, 也可称为灵活的多种被分析物质的检测 (flexible multi-analyte profiling, x MAP) 技术, x MAP技术是集流式技术、荧光微球、激光、数字信号处理和传统化学技术为一体的一种新型生物分子高通量检测技术, 这种技术将流式检测与芯片技术有机地结合在一起, 使生物芯片反应体系由液相一固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系, 因此也被称为液相芯片技术[21]。袁静等[22]针对H7亚型禽流感基因, 设计特异性引物和探针, 将合成的探针与荧光编码微球进行偶联, 建立液相芯片检测方法, 用己知基因型的样本对这种方法进行验证显示它的特异性很好。灵敏度分析实验也表明这种方法具有很高的灵敏度, 可以对含有5个拷贝的样本进行有效的基因分型, 同时检测速度快, 此方法从样本RNA的提取到最后结果的判断可以在1个工作日 (8 h) 内完成。
6 重组酶介导的等温扩增法
重组酶介导的等温扩增 (Recombinase aided amplification, RAA) 方法利用重组酶, 在恒定温度下使引物和模板DNA发生链置换反应, 并在30 min内即可大量扩增模板DNA[23]。赵康辰等[24]根据H7N9禽流感病毒HA片段和NA片段的保守区序列分别设计引物及探针, 建立RT-RAA方法, 结果显示, H7反应体系和N9反应体系的最低检出限分别为10拷贝/μl, 和100拷贝/μl, 且与其他呼吸道病原无交叉反应。H7N9 RT-RAA体系检测结果与Real-time RT-PCR一致性较高, Kappa检验u系数为0.933, 提示该方法可作为Realtime RT-PCR检测的替代工具, 适合用于禽流感病毒H7N9的快速检测。重组酶介导扩增法仅需要在37℃反应1 h即能得到与高温PCR相同的结果, 用时少及操作简单, 而且只需要一个恒温装置 (如水浴或金属浴, 甚至是恒温培养箱) [25]。
7 高通量测序
高通量测序技术 (high-throughput sequencing, HTS) 是以一次并行对几十万到几百万条DNA分子的序列测定和一般读长较短等为标志的技术[26]。高通量测序一次实验可以读取40万到400万条序列。读取长度根据平台不同从25碱基到450碱基, 不同的测序平台在一次实验中, 可以读取1 G到14 G不等的碱基数[27]裴广倩等[28]提取3份样本RNA, 反转录, c DNA (互补DNA) 扩增, 进行高通量测序, 结果显示3个样本的8个片段都可以检测出并且可以判断其类型, 利用高通量测序技术可以快速的检测H7N9禽流感病毒。王楷宬等[29]研究显示在一次测序中完成了H7N9禽流感病毒全部8个基因的序列, 能够满足对H7N9亚型流感监测、全基因分析和溯源研究的要求。
8 环介导等温扩增
环介导等温扩增技术 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶, 在等温条件 (6~65℃) 下60 min左右进行核酸扩增, 其扩增效率可达到109~1010个数量级, 具有特异性强、灵敏度高、等温、操作简单和检测结果快速等优点[30]。崔淑娟等[31]采用RT-LAMP技术检测H7N9人禽流感病毒, 根据H7N9人禽流感病毒HA基因的保守序列, 设计一套针对HA基因的7个区域的5条特异性引物, 优化反应体系与扩增条件。结果显示, 该方法能够特异检测出H7N9人禽流感病毒, 并且灵敏度高, 最低检出限为0.01pg, 对69份临床疑似标本利用该研究建立的RT-LAMP法和实时荧光RT-PCR法同时进行检测, 其检测结果的灵敏度、特异度和总符合率均为100%。另外, 扩增方法只需要45 min即可判读结果。董志珍等[32]利用LAMP检测H7N9禽流感病毒, 其灵敏度达到10个拷贝, 灵敏度与实时RT-PCR一致, 但从检测时间上看LAMP完成1次检测可在1.5 h内, 而实时RT-PCR则需要3 h。因其不需要精密昂贵的检测设备, 适合在基层进行H7N9禽流感病毒的快速检测, 并可以应用于大流感疫情的准确筛查。
9 多重PCR-酶联免疫吸附法
是结合了分子生物学和免疫学检测方法, 通过普通PCR扩增, 以酶联免疫吸附反应 (ELISA) 作为最终结果判定手段。章倩云等[33]针对禽流感病毒M基因 (M) 、H7基因 (H7) 、N9基因 (N9) 3个基因片段的保守序列, 通过生物素与地高辛的特异性标记, 建立PCR-ELISA方法。结果显示, M、H7和N9 3个基因片段所能检测的最低拷贝数分别为1.43×103拷贝/μl、1.04×102拷贝/μl、8.80×103拷贝/μl, 其敏感度比普通PCR扩增提高了10倍~100倍, 能检测到102个拷贝数的核酸样品。特异性高, 不同亚型禽流感病毒之间不存在交叉反应现象。另用该法检测了114个临床标本, 结果准确率与病毒分离完全一致, 匹配率达100.0%。
10 结语
综上所述, 分子生物学技术为H7N9禽流感病毒提供了高敏感度、强特异性且准确快速的诊断, 为疫情的有效防控提供了宝贵的时间和必要的技术支持, 避免了疫情的大范围蔓延。但分子生物学技术并不能解决所有问题, 有一定的局限性。随着现代分子生物学、微生物学及免疫学等学科的发展, 以及同其它学科间的渗透, H7N9禽流感病毒的传统检测技术将与现代分子生物学技术有机结合, 取长补短, 推进H7N9禽流感病毒分子生物学技术进入新的发展阶段。
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