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摘要：基因检测方法以其快速、准确、高效、灵敏的特点在食品的真伪鉴别中得到广泛运用。文章对燕窝检测中的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光PCR、分子指纹、基因芯片、基因测序等基因检测技术现状进行了综述,并对以后的发展进行了展望,以期为研究者提供一定的理论参考。
关键词：燕窝; 基因检测; 真伪鉴别;分子生物学
基因是生物遗传信息的载体,以脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)的形式存在于所有组织和细胞中。遗传信息直接决定了生物体的本质,所以,通过基因对生物物种进行鉴别是权威和科学的方法。随着生物学的发展,快速、准确分析基因信息的技术方法不断出现,如聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、实时荧光PCR、分子指纹、基因芯片、基因测序等。由于分子生物学检测方法具有特异性好、灵敏度高以及方便快捷等优势,因此在真伪鉴别中也得到了运用。
燕窝作为一种唾液和绒羽的混合物,其唾液中口腔上皮细胞和绒羽的构成细胞,可提供相关的生物信息。燕窝中糖蛋白存在的主要形式是粘蛋白,不易分离,黄秀丽等[1]利用液相等点聚焦电泳,使燕窝水提蛋白质以及丙酮沉淀蛋白质无杂质干扰,满足电泳分析的需要。同时,黄秀丽课题组研究燕窝中的蛋白质样品制备的方法,发现80%丙酮作为蛋白沉淀剂不仅能有效去除杂质,而且分离效果更佳。林洁茹等[2]将SDS-PAGE应用于燕窝中蛋白质分离,并应用等点聚焦电泳实现燕窝真伪识别。郭丽丽等[3]将双向电泳技术用于燕窝中水溶性蛋白的分离和鉴定。研究人员利用不同的方法对燕窝及其制品进行DNA提取,建立了有效快速的DNA提取方法,为生物方法用于燕窝真伪测定的发展提供依据。
1 PCR技术及其在燕窝检测中的运用
PCR技术是一种体外核酸扩增技术,以待扩增的两条DNA链为模板,在1对人工合成的寡核苷酸引物的介导下,通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用,快速特异地扩增出特定的DNA片段。随着科技的发展,研究人员将PCR技术大量改进,由此产生了一系列相关PCR技术方法,其中包括原位PCR、巢式PCR、反向PCR、锚定PCR、多重PCR、不对称PCR、重PCR、标记PCR、免疫PCR等主要用于定性检测的技术。1996年,实时荧光PCR技术的诞生,PCR技术实现了从定性到定量的飞跃。实时荧光PCR技术通过在反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号监测PCR反应过程,然后根据标准曲线对未知模板进行定量。
何国林等[4]设计1条具有良好特异性和灵敏度的特异靶向雨燕属和金丝燕属细胞色素基因的Taq Man探针,结合实时荧光PCR技术对燕窝样品进行检测分析;Lin等[5]建立了以线粒体细胞色素b基因为靶标的燕窝遗传学分子鉴定方法。通过对11个燕窝样品中线粒体细胞色素b基因的PCR扩增、测序及序列比对、聚类分析后,发现该方法能够将燕窝来源区分开,同时认为该方法具有用于燕窝真伪鉴定的可能性。实时荧光PCR法以及双向电泳法作为燕窝测定的行业标准得到广泛应用,作为分子生物学鉴定方法可以准确地检测燕窝成分;Wu[6]等将PCR技术和双向凝胶电泳技术应用于真伪辨别中。PCR技术主要用于评价产品中燕窝成分的存在,灵敏度比较高,可检测0.5%燕窝含量的银耳燕窝类加工制品,而双向凝胶电泳则可确定燕窝蛋白占总蛋白的比例;王凤云等[7]探究了32种不同品种和产地燕窝的生物基原,对其中的DNA进行提取、扩增和测序后,利用MEGA 6.0软件进行序列比对,分析变异位点,计算Kimura-2参数遗传距离,构建邻接(NJ)系统发育树,从而鉴别燕窝的基原。结果表明,NJ系统发育树显示相同生物基原的燕窝物种将聚为1支,其所建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性、重复性和稳定性等特点。
2 DNA指纹技术
DNA指纹技术建立在DNA分子标记基础上,以生物个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记(分子标记),直接在DNA水平上检测生物个体的差异,是生物个体在DNA水平上遗传变异的直接反映。DNA分子指纹技术种类繁多,包括限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism,RFLP)、简单重复序列(Simple Sequence Repeats,SSR)、随机扩增多态性(Randomly Amplified Polymorphic DNA,RAPD)、扩增长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)、单链构象多态性(Singlestrand Conformation Polymorphism,SSCP)、变性高效液相色谱(Denaturing High Performance Liquid Chromatography,DHPLC)等技术。
DNA指纹技术主要具有如下优点:1.不受组织类别、发育阶段等影响;2.不受环境影响;3.标记数量多,遍及整个基因组;4.多态性高,自然存在许多等位变异;5.有许多标记表现为共显性,能鉴别纯合基因型和杂合基因型,提供完整的遗传信息;6.DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化;7.提取的DNA样品在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定是非常有利的。因此,DNA指纹技术可应用于动、植以及微生物源性产品的真伪鉴定、掺假鉴定以及名特优产品产地溯源鉴定。
罗志勇等[8]采用AFLP指纹遗传标记技术分析了人参、西洋参、引种西洋参基因组多态性,经凝胶电泳检测,成功构建了多态性广、重复性好的指纹图谱,为人参、西洋参等的鉴定提供了依据;张铭等[9-11]采用RAPD指纹技术对15种铁皮石斛、石斛属的26个种和金石斛属的1个种及13种石斛属植物进行鉴定,成功地将铁皮石斛和金石斛属等石斛属植物区分开,为鉴别市售的伪劣铁皮石斛提供了有效指纹鉴别图谱;孙淑霞等[12]利用ISSR标记对28份桃种进行了品种鉴定及亲缘关系检测,获得了相关指纹图谱,筛选出9条特异DNA片段和11条特异缺失DNA片段,为有效地鉴别桃的品种、桃种质资源研究和新品种保护提供理论基础;杨文毅等[13]利用48个SSR分子标记对来自9个不同国家的90个水稻品种进行了遗传相似性分析,结果共检测到269个等位基因,90个品种在相似系数0.12处,分为籼、粳2个亚种类群,在聚类树形图上可以有效地追溯到各品种的地理来源。
尽管DNA指纹技术在生物源性食品中具有很强的优势,然而当前国内外未曾见到有采用该技术对燕窝及其制品的检测鉴定的研究报道。这可能是因为燕窝及其制品在形成商品前,经过了一定程度的加工。而在加工过程中降解了部分DNA,富集到的DNA片段多为小分子量的DNA片段,因此不能建立具有特异性的DNA指纹图谱。然而,在针对燕窝的掺假检验与产地溯源检验中,可以联合应用DNA指纹技术应与理化检测技术,为更准确地鉴别假冒伪劣食品和溯源优良品种原材料产地提供技术支持。
3 基因芯片技术
基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA microarray),20世纪80年代末,基因芯片技术迅速发展,并成为生命科学领域一项高新技术,是一项基于基因表达和基因功能研究的革命性技术。基因芯片运用DNA分子作为探针的生物芯片,在一个微小的载体表面点阵式排布大量的可寻址的探针分子,通过目标基因与探针之间的配对反应对目标基因进行分析,获得的光信号、电信号或磁信号被检测仪器记录并转换成数字信号,然后由计算机软件自动分析、解读实验结果。
基因芯片技术在一次实验中就可以对成千上万的靶标基因进行测定,鉴于高通量的技术特点,可以运用于复杂成分的筛查。目前基因芯片正在成为食品和食品原料检测中一种较新的方法,检测食品的营养成分,监督食品的卫生、安全和食品质量,保证人类健康,并且将对整个食品领域产生深刻的影响。Borucki等[14]成功构建了一种可准确鉴别24种近缘单核增多李斯特菌微阵列基因组芯片;Lee等[15]建立了一种基因芯片检测技术可同时检测7种奶牛乳房炎常见病原微生物(金黄色葡萄球菌、乳房链球菌、牛棒状杆菌、牛支原体、牛链球菌、停乳链球菌和无乳链球菌),该基因芯片能在6h内完成整个检测过程,且灵敏度高,目前已成功应用于临床;成晓维等[16]选取9种常见转基因食品外源基因,制备一种可视芯片,可以一次检测出5种的常见转基因植物(转基因玉米、大豆、水稻、油菜、小麦),该方法灵敏度可达0.1%,同时摆脱了基因芯片在杂交结果分析阶段对荧光扫描仪的依赖,杂交结果明显直观;Kellya[17]等制备了一种基因检测芯片,与从工业废水处理厂收集样品提取并通过羟自由基的方法标记核酸的rRNAs,进行杂交,证明了硝化细菌可以借助不需要PCR扩增的芯片杂交来直接检测到。
然而,基因芯片检测技术需要大量已测知且准确的遗传信息作为基础,所涉及使用的仪器设备价格昂贵,同时对操作人员的专业素质要求较高。因此,使用基因芯片技术检测燕窝的研究报道鲜有报道。
当前,人类已经进入大通量、大规模、大范围的基因研究阶段[18],作为一项高新技术,基因芯片技术具有十分诱人的前景,但要运用到食品安全检测中还需解决以下问题:1.芯片制作工艺复杂,信号检测需要专门的仪器设备,价格昂贵;2.样品制备和标记比较复杂,没有一个统一的质量控制标准;3.实验室不能共享数据和资料库等。这些都在一定程度上限制了基因芯片技术的运用。为使基因芯片成为实验室研究或实践中可以普遍采用的技术,须从以下几方面着手解决问题:1.提高基因芯片的特异性、重复性;2.简化样品制备和标记操作;3.增加信号检测的灵敏度;4.研制和开发高度集成化的样品制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器。
基因芯片技术尽管存在一定的不足和局限,但该技术具有检测系统微型化、检测样品微量化的特点,同时兼具检测效率高、能同时分析多种基因或诊断DNA序列的优势,很适于食品检测及鉴定。随着研究的不断深入和技术的完善,基因芯片技术一定会在燕窝检测鉴定,乃至食品科学研究领域发挥越来越重要的作用。
参考文献
[1]黄秀丽,赖心田,林霖,等.液相等电聚焦电泳纯化燕窝蛋白质[J].食品科学,2011,32(12):10-13.
[2]林洁茹,周华,赖小平,等.燕窝DNA提取方法研究[J].世界科学技术:中医药现代化,2010,12(2):202-210.
[3]郭丽丽,吴亚君,刘鸣畅,等.双向电泳技术分离燕窝水溶性蛋白[J].食品科学,2013,34(24):97-101.
[4]何国林,陈念,刘鹏,等.Taq Man实时荧光定量PCR鉴定燕窝方法的建立[J].生物技术通讯,2015,26(1):111-115.
[5]Lin JR,Zhou H,Lai XP,et al.Genetic identification of ediblebirds'nest based on mitochondrial DNA sequences[J].Food Res Int,2009,42:1053-1061.
[6]Wu Y,Ying C,Wang B,et al.Application of SYBRgreen PCR and 2DGE methods to authenticate edible bird's nest food[J].Food Research International,2010,43(8):2020-2026.
[7]王凤云.基于DNA条形码及实时荧光定量PCR技术的燕窝鉴别研究[D].广州:广州中医药大学,2015.