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摘要：STIL基因是从急性T淋巴细胞白血病基因中克隆而来, 作为一种癌基因, STIL与生物体内中心体的生成、复制及细胞有丝分裂密切相关。中心粒是细胞分裂的控制中心。STIL与PLK4 (一种中心粒复制相关蛋白) 在细胞分裂的G1期中期组成包含有卷曲螺旋结构域 (coiled-coil domain, CCD) 和STAN模体 (STAN motif) 的复合体参与中心粒的形成、复制, 调控细胞有丝分裂, 并且生成中心体的数量与STIL蛋白含量成正比。进一步的研究发现, 在神经系统中STIL截断突变基因 (STILT) 通过影响中心粒的增殖从而导致小头畸形症 (MCPH) 的发生, 并与全前脑畸形 (HPE) 的发病有关。增强STIL介导的Shh信号转导通路可以降低视网膜多巴胺能细胞对神经毒素的敏感性, 从而保护视网膜。经研究发现, STIL在多种肿瘤组织均有表达, 并通过调节中心体的结构和数目, 影响染色体不稳定性形成参与恶性肿瘤发生、发展及转移。在肺癌特别是非小细胞肺癌中STIL呈过表达状态。在胰腺癌中, STIL在Hedgehog信号通路中通过与SUFU (融合抑制蛋白) 和Gli (一种锌指蛋白) 相互作用导致胰腺癌的发生。本篇综述旨在探讨STIL在中心粒复制和细胞增殖方面的作用, 揭示其与神经系统疾病及恶性肿瘤发生的关系及潜在机制, 为疾病的预后和治疗提供新的方向。
关键词：STIL; 中心粒; 增殖; 恶性肿瘤;分子生物学
STIL (SCL/TAL1 interrupting locus) 基因是从人类急性T淋巴细胞白血病相关染色体重排中克隆而来的, 作为一种癌基因, STIL的进化高度保守。STIL与生物体内中心体的生成、复制及细胞有丝分裂密切相关。中心体作为一种重要的细胞器, 是细胞分裂时的控制中心, 若中心体复制异常, 则会影响细胞正常的有丝分裂, 使得染色体分配不均, 导致非整倍体细胞的出现, 这是许多神经系统疾病及恶性肿瘤的发病基础。STIL作为中心粒的调控因子及其在Hedgehog和Shh信号通路中的作用与多种疾病的发生发展密切相关。本文主要对STIL的分子生物学特性及其在神经系统疾病和恶性肿瘤中的作用机制进行综述。
1 STIL基因的结构与功能
STIL基因 (又称SIL基因, SCL/TAL1 interrupting locus) 最初是从急性T淋巴细胞白血病的染色体重排中克隆而来的, 定位于1p32, 其逆转录产物c DNA由3681 bp组成, 编码一个包含1 287个氨基酸序列的开放阅读框架, 相对分子质量为143 000[1]。STIL/SCL基因的重排使得STIL内显子1和SCL内显子1相并列, 形成融合的STIL/SCL mRNA (STIL外显子1以头尾相接的形式连接SCL外显子3) 。STIL启动子调控造血转录因子SCL的表达, 使SCL基因表达异常并导致了白血病的发生[2]。
中心粒是中心体和初级纤毛的重要结构, 为圆柱状的九倍体结构, 其复制是一项严格调控的过程, 在纤毛中它们以自身的九组微管为模板进行复制, 前中心粒垂直连接在母中心粒上, 构成了中心体的核心结构[3]。目前为止, 仅确认包括SPD2/CEP192、ZYG1/SAK/PLK4、SAS4/CPAP、SAS6和SAS5/ANA2/STIL在内的几种进化保守的蛋白在低级生物果蝇、线虫和人类的中心粒复制中起作用。通过siRNA和免疫电镜检查显示人类细胞中心粒的模式化复制是通过激活PLK4 (一种中心粒复制相关蛋白) 的活性以及将CEP152聚集到亲代中心粒表面来进行的。STIL和SAS6聚集到新生成的前中心粒的底部, 并与来自中心粒轮状结构的CEP135相互作用。CACP随后参与中心粒外部9个三联体微管的组成, 并在PLK4的帮助下介导中心粒的扩增。PLK4在G1期中期与STIL结合并对其进行磷酸化, 形成PLK4-STIL复合体后对中心粒复制进行调控, 该复合体包含卷曲螺旋结构域 (coiled-coil domain, CCD) 和STAN模体 (STAN motif) [4-6]。CCD是中心体蛋白中普遍存在的一种结构[7]。近来的研究显示[5], STIL蛋白中的CCD介导了PLK4-STIL复合体的形成, 并使得PLK4的激活成为了中心粒复制的重要起始步骤。David A等[8]通过实验发现了参与低聚反应、中心体定位以及STIL蛋白相互作用的特定CCD蛋白残基。将此结构分为2个部分, 其中包括一个含有8个疏水基的残基, 主要参与螺旋结构之间的低聚反应, 该反应对于在生物体内重新合成中心体和初级纤毛是必不可少的。
Vulprecht J等[9]使用经单克隆鼠抗体拮抗STIL蛋白表达的细胞以及稳定表达STIL蛋白的U2OS细胞在相同的实验条件下进行有丝分裂实验, 发现STIL在有丝分裂间期的G1期中期即开始积聚前中心粒的相关物质, 一直持续到有丝分裂中期, 并在有丝分裂末期随中心体一起消失。在细胞分裂间期中STIL来回穿梭于细胞质和中心粒之间, 在G1期的交换速率远快于S期和G2期, 这显示其大规模的穿梭主要发生在前中心粒的形成时期, 而且生成中心粒的数量与STIL蛋白含量成正比。Nigg EA等[10]与Zitouni S等[11]对此过程进一步研究后发现:STIL对有丝分裂的调控包含2个步骤, 第1步, 在有丝分裂前中期开始时, 细胞周期蛋白激酶-1 (cyclin-dependent kinase 1, CDK1) 通过与STIL相关结构域的竞争性结合来阻止PLK4-STIL复合体的生成及STIL的磷酸化使得STIL与中心粒分离;第2步, 在有丝分裂后期, 对细胞质内STIL的降解依赖泛素进行。与之前的研究结果相一致[12], 该过程还需要一种细胞周期泛素连接酶-促细胞分裂后期复合物 (APC) 的参与。当有丝分裂结束之后, 随着CDK1的失活, PLK4继续与STIL结合并进行磷酸化, 磷酸化之后的STIL蛋白募集SAS6蛋白[13], 在G1期向S期过渡时形成新的轮状结构之后开始新一轮的中心粒复制[14]。这项发现为中心粒轮状结构分解的机制和时间选择提供了可能的解释。
2 STIL在神经系统中的研究
原发性小头畸形症 (primary recessive microcephaly, MCPH) 是一种神经系统发育缺陷导致的多基因隐性遗传疾病[15]。MCPH的典型特征是出生后脑容量减小及非进行性智力退化。目前, 已发现约10个与小头畸形发病相关的作用位点, 并且这些基因编码蛋白的表达大多都与中心体蛋白或有丝分裂纺锤体有关。而先前已发现的STIL截断突变基因已被证实可以引起小头畸形症[16-17]。STIL截断突变基因 (STIL truncating mutations, STILT) 参与形成一种提前中止密码子, 并且移除羧基端的KEN-box (包含约69个氨基酸) 。STILT的表达使得STIL在细胞质内表达水平的稳定性受到影响, 更重要的是STILT也可以像STIL一样聚集在中心粒周围并与之分开, 2种基因在促进中心粒合成时的作用一致, 这显示去除掉KEN-box之后对于STIL的功能并无实质影响, 而STILT真正的作用在于影响中心粒的扩增[18]。一项新的研究显示, 由于PLK4的过表达而导致鼠类大脑内的中心粒扩增, 并且非整倍体的神经干细胞被p53蛋白所介导的细胞凋亡机制清除从而导致小头畸形症[19]。Arquint C等[20]通过实验证实在小头畸形症患者中所获得的STILT在细胞质内稳定存在STIL的情况下引起中心粒扩增, 因此更进一步说明了中心粒的扩增和细胞分裂时的内在缺陷导致人类神经系统发育障碍。
全前脑畸形 (holoprosencephaly, HPE) 也称前脑无裂畸形, 是由于大脑中线畸形导致前脑未能完全分裂或部分分裂。按照分化程度不同, 全前脑畸形可分为3种类型, 包括无叶型、半叶型和叶型, 其中无叶型最严重, 叶型最轻[21]。多数患者还伴有面部畸形, 包括独眼、眼距过近、中央唇裂、喙鼻等。全前脑畸形的神经系统症状有神经发育迟缓、智力低下、癫痫、下丘脑、脑干及垂体的功能障碍。在所有已知的全前脑畸形症中约有25%~50%的病例是由于原始染色体缺陷导致的[22]。更进一步的研究发现, 某些基因的变异体也可以引起常染色体显性遗传的全前脑畸形, 并且这些发现为Shh (sonic hedgehog) 信号通路在HPE中的研究起了重要作用。目前已知的引起HPE的基因变异体包括:SHH、ZIC2、SIX3和TGIF1, 但只有约25%的HPE与这些基因有关, 更多的致病基因仍有待发现[23]。Kakar N等[24]通过对具有相近血缘关系且均患有原发性小头畸形症 (MCPH) 的5个核心家庭成员进行研究, 通过对亲代及子代进行脑部MRI扫描和DNA测序发现, 引起MCPH的致病基因STIL截断突变基因 (STILT) 也可以导致PHE的发生。该研究小组通过RT-PCR分析发现, 在染色体1p33-p32.2上存在着STIL截断突变基因, 该基因去掉了外显子5从而形成了外显子4和外显子6的融合突变体。目前仅已知STILT可以导致HPE, 但尚无法明确其具体的发病机制以及引起何种类型的HPE, 这也是下一步的研究方向。
Li J等[25]曾分离得到一种夜盲基因的突变体 (night blindness b, nbb) , 该基因可引起斑马鱼视网膜多巴胺能细胞 (DA Cell) 的迟发性退化, 并且证明nbb与STIL是同源基因。通过实验证实在野生型斑马鱼 (含有STIL基因) 中加入亚毒性浓度的多巴胺能细胞特定毒素6-羟多巴胺 (6-OHDA, 已知专门破坏DA细胞的毒素) , 野生型斑马鱼的视网膜DA细胞并未减少。然而, 在含有nbb突变基因的斑马鱼中加入同等剂量的6-羟多巴胺毒素, 可发现视网膜DA细胞明显减少。含有nbb突变基因的斑马鱼对于毒素敏感性的提高与在野生型斑马鱼中同时加入6-OHDA和环靶明 (cyclopamine, 一种Shh通路中Smo受体拮抗剂) 相似。有趣的是, 使用吗啉寡核苷酸反序列敲除 (morpholino-knockdown) SUFU基因可以上调Shh通路的表达, 进而降低nbb突变体对于神经毒素的敏感性。所以, 缺失STIL基因或者阻断STIL介导的Shh信号转导通路会导致视网膜多巴胺能细胞增加对神经毒素的敏感性, 而增强Shh信号转导通路可以保护视网膜多巴胺能细胞, 并且降低对神经毒素的敏感性, 这说明STIL具有神经保护作用[26-27]。
3 STIL在肺癌中的研究
鉴于STIL基因在细胞形成、扩增及在细胞分裂中的调控作用, 显示STIL可能是一个潜在的肿瘤致病基因。Ramaswamy S等[28]通过绘制基因表达图谱来对恶性肿瘤转移组织和原发灶进行对比, 发现了一系列与肿瘤转移相关的基因, 其中包含STIL基因, 并且证实STIL表达高的个体易发生肿瘤转移且临床预后不良。Erez A等[29]使用TARP染色法对大量的肿瘤组织进行观察, 结果显示在包括黑色素瘤、肺癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌及宫颈癌在内的肿瘤组织中STIL均有表达。该研究小组又通过Western Blot法观察到STIL在肺癌组织中的表达最高, 并且在同一肺癌组织的不同标本中也存在表达差异。Erez A等[29]又选取了5种类型的肺癌组织, 经过DNA基因芯片的检测, 结果显示STIL在约1/3的非小细胞肺癌中呈过表达状态, 但是目前尚无证据表明STIL的表达程度与肿瘤的组织学类型和病理分期有直接关系。该研究小组通过对不同来源的2组肺癌组织进行基因分析并进行对比, 发现了5种共有基因, 其中4种在有丝分裂时对着丝粒检查点进行调控。而STIL的作用功能恰好与这些基因类似。上述实验通过对肺癌组织的基因学分析, 揭示了STIL与着丝粒检查点基因在有丝分裂时的共作用关系。Grinberg-Rashi H等[30]使用RT-PCR技术对12种不同基因在142例非小细胞肺癌组织中的表达进行研究, 并使用COX多因素分析来探究各个基因与脑转移的关系, 结果发现STIL基因与肺癌的脑转移尚无明确关联。
4 STIL在胰腺癌中的研究
Hedgehog是一种共价结合胆固醇的分泌性蛋白, 脊椎动物中至少有3个基因编码Hedgehog蛋白, 即:Shh (sonic hedgehog) 、Ihh (indian hedgehog) 和Dhh (desert hedgehog) 。2个跨膜蛋白Patched (Ptc) 和Smoothened (Smo) 介导Hedgehog (Hh) 信号向胞内传递。Hedgehog信号通路对于胚胎的发育、身体内干细胞的平衡和组织内环境的稳定具有重要作用[31-32], 而且该信号通路中重要的组成物如Suppressor of Fused (SUFU, 融合抑制蛋白) 、Gli (一种锌指蛋白) 和Ptc等的变异产物能够导致肿瘤的发生[33]。Gli锌指蛋白家族由2种蛋白构成, 分别为Gli1、Gli2和Gli3。Gli1的活性是由SUFU通过2种机制来直接调控的:第一, SUFU与Gli1的氨基端和羧基端各自相结合形成复合物并进入细胞质中[34-35];第二, 在某些条件下SUFU进入到细胞核中与Gli1相结合并募集SAP18-m Sin3共阻遏物复合体来共同发挥作用[36]。这2种机制的最终结果都是Gli1作为靶基因而被抑制。STIL基因缺失的小鼠胚胎容易出现左右发育不对称且在发育早期死亡[37], 而在缺失Shh基因[38-39]及STIL和Patched双基因缺失且Hedgehog信号通路显性表现的胚胎中也出现了相似情况[40]。这显示STIL基因在Hedgehog信号通路中也是必不可少的。Kasai K等[41]通过胰腺导管腺癌对STIL调控Hh信号通路的分子机制进行研究, 结果发现Su Fu在正常胰腺导管上皮及癌组织中均有存在, 而STIL在正常胰腺导管上皮仅微量存在, 在癌组织中大量存在。STIL通过与Su Fu的C端强结合及与N端的弱结合形成STIL-Su Fu复合体来竞争性抑制Su Fu与Gli1的结合, 此时Gli1由细胞核中脱离出来转变成为了转录因子, 并且肿瘤基因K-RAS能增强STIL与Su Fu之间的结合, 而Shh无此作用。
综上所述, STIL基因在中心粒生成、染色体复制及细胞有丝分裂时均发挥了重要作用。并且, STIL的神经保护作用和在MCPH及HPE中的功能使得其成为治疗该病的一个重要靶基因。而作为一种癌基因, 探究STIL在多种肿瘤中表达、转移的机制可以对预后做出更准确的评估以及进行更精准的分子靶向治疗。
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